细菌脂多糖生物合成途径及关键酶性质研究

细菌表面含有丰富多样的多糖，在众多生物过程中起着关键作用。目前，多种细菌多糖已应用于疫苗开发，然而其生物合成研究基本局限于体内的基因操作，缺乏直接的生化证据，仍有许多关键问题尚待阐明。本项目拟以致病性大肠杆菌O157:H7为模式菌株，体外研究该生物过程及关键酶的性质。首先克隆表达该生物合成途径中的三个糖基转移酶，化学酶法合成多糖聚合的重复单元。然后通过条件、质粒、菌种优化及伴侣蛋白共表达等方法过量表达脂多糖合成中的三个膜蛋白关键酶：Wzy、Wzz、WaaL，并以合成的重复单元和提取的类脂A核心寡糖为底物体外重建整个脂多糖合成途径，包括多糖聚合、糖链控制和脂链连接。继而以此为模型，研究三个关键酶的生化性质，相互作用关系及对脂多糖合成、链长控制的影响。另外，拟阐明Wzy聚合反应的方向等问题。这些研究将为深入探讨细菌多糖合成中关键酶的作用机理提供理论基础和完善的模型。

本项目成功克隆表达了大肠杆菌脂多糖合成途径中的三个糖基转移酶，并对其多糖合成重复单元进行了合成。克隆表达了关键酶WaaL，对大肠杆菌O157的脂多糖合成进行了体外重建。并利用模式菌种（大肠杆菌O86）对该WaaL进行了详细的性质研究，发现WaaL对糖基供体具有极为广泛的适应性。另外在该研究的资助下，我们进行了糖核苷酸及衍生物的合成。这些糖核苷酸是合成大肠杆菌O157等的脂多糖的重要单元。我们发现了一个高活性的半乳糖激酶，是现有常用同类酶活性了进300倍。另外发展了一种一锅多酶合成GDP-单糖的新方法，并成功合成了10余种GDP-单糖及衍生物。