长非编码RNA DSCR9对唐氏综合征中枢神经系统发育异常的调控机制研究

Down syndrome (DS), also known as trisomy 21 syndrome, is a chromosome abnormality caused by the presence of all or part of a third copy of chromosome 21.  DS patients show general developmental defects in nervous system. It has been found that DS incidence is associated with the Down syndrome critical region (DSCR) on chromosome 21, whereas its pathogenic mechanism remains unclear. Our meta-analysis of gene-expression profiling from nearly sixty thousand microarrays identified that a long non-coding RNA, DSCR9, regulated the expression of 29 genes related to neurological functions. We assumed that DSCR9 RNA played important roles in DS pathology. Our preliminary results showed depressed DSCR9 RNA abundance in the DS fetal amniotic fluid cells compared to healthy fetus cells, supporting its involvement in DS. We proposed to employ a series of functional studies, including CLIP-Seq, over-expression and RNAi in the induced-differentiated neurons derived from amniotic fluid stem cells, to evaluate the effects of DSCR9 on neuron differentiation and other DS related phenotypes. Our studies aim to prove that DSCR9 is an important factor regulating the expression of various nervous system-related genes, and to verify our hypothesized regulatory mechanism - the inhibited expression of DSCR9 RNA during embryonic development may shut down its target genes, leading to the abnormal neuron differentiation and hence DS occurring. Our results will provide a novel theoretical basis for the DS clinical therapy, as well as the discovery of drug-targets.

唐氏综合征因细胞内存在一条额外的21号染色体，又称21三体综合征，患者普遍有中枢神经系统发育异常的表现。现有研究发现DS发病与21号染色体上唐氏综合征关键区域有关，但其致病机制不明确。本课题对近六万张基因表达芯片进行荟萃分析发现DSCR区域有一条长非编码RNA—DSCR9，控制29个神经系统功能相关基因的表达，推测它与DS神经系统发育异常密切相关；进一步通过qPCR发现 DSCR9在DS胎儿羊水中的表达量低于正常胎儿，证实DSCR9与DS相关。因此提出新假说：推测胚胎发育过程中DSCR9异常表达影响了神经系统相关基因表达，导致DS神经系统发育异常｡本课题拟利用羊水细胞构建DS模型的iPSC，分化为神经元细胞，采用膜片钳、过表达和RNA干扰以及Clip-seq等方法，分析DSCR9对对神经元的影响，获得DSCR9调控神经系统相关基因表达的证据，为DS的临床治疗提供理论依据和药物靶点研究方向。

长非编码RNA(LncRNAs)在一系列生物学过程中扮演着重要角色，LncRNA调节失调与包括神经疾病在内的人类疾病有关。我们发展了一种多步骤的生物信息学分析方法蛋白交联网络分析平台（COIN）来研究特定的唐氏综合征相关基因DSCR9的功能。我们找出DSCR9相关的调控基因群，将表达量与DSCR9有正/负相关关系的基因，通过correlation函数，找出相关性大于0.40的相关基因，显著调控的基因一共有205个,根据COIN结果，与DSCR9共表达关系最强烈的生物通路主要是：1.与神经活性配体-受体相互作用（GLP1R，HTR4，P2RX2，UCN3和UTS2R）；2.钙信号通路（CACNA1F，CACNG4， HTR4，P2RX2和SLC8A3）；3.神经元系统（KCNJ5和SYN1）。通过COIN平台结果可以看出，DSCR9是一个与神经调节功能密切相关的lncRNA。我们分析了人体各种细胞的lncRNA表达量结果，结果显示DSCR9在心肌细胞和大脑细胞中检测到了最高表达水平，而且与大脑的其他区域相比，DSCR9的丰度似乎在海马体中积累更高。这与COIN预测的结果及我们预期吻合，即该lncRNA可能是导致树突分支和脊柱数目异常以及脑容量进一步减少的因素。为了进一步验证DSCR9的神经功能相关性，我们构建了具有稳定DSCR9过表达的A549和U251细胞系，在A549和U251细胞中构建和验证DSCR9过表达后，在预测基因中选择了15个与DSCR9相关的基因，并通过qPCR确定了它们的表达水平。我们发现，在A549细胞中DSCR9过表达后，这15个预测的共表达基因中有12个不受调控，而在U251中它们中有11个被上调。在DSCR9的COIN分析中，确定了与DSCR9高度相关的三个转录因子，包括Rad21，USF1和USF2，并且这些转录因子的推定结合位点存在于DSCR9的最后一个外显子范围，跟L1CAM的差异结合峰位置非常接近，提示这个L1CAM结合区域确实是DSCR9调控的关键区域。本研究进一步揭示了DSCR9的可能作用机制，为揭示长非编码RNA DSCR9参与神经系统调节提供了一定的理论依据。