O157多糖蛋白疫苗的糖链数目及长度最佳配比研究

The polysaccharide-based vaccines provide an attractive approach for fighting the infectious diseases. Many results showed that the numbers and the length of the polysaccharides conjugated to the protein affected the efficient of the vaccines. The traditional chemical approach suffers from multiple fermentations, purification steps, low yields, and therefore, leading to the high cost of vaccine production. The objective of this proposal is to explore bacterial protein glycosylation systems to obtain polysaccharide conjugate vaccines in an efficient and easily biological way. In addition，regulation of the chain number and the length of O-antigens in the glycoconjugates vaccine will also be attempted.

多糖蛋白缀合疫苗占目前多糖疫苗的多数。最新研究结果表明，糖链结合数目和糖链长度配比严重影响多糖蛋白缀合疫苗的免疫效果。目前多糖蛋白缀合疫苗生产多采用化学缀合方法，这一方法很难控制糖链和蛋白的结合，因此难以实现糖链结合数目及糖链长度最佳配比。本申请的目标在于试图通过生物法来实现这一目的。主要是以大肠杆菌O157:H7为例，利用细菌蛋白糖基化系统和细菌脂多糖（LPS）合成途径，通过对蛋白糖基化改造和宿主菌LPS合成途径相关酶的研究及改造，构建重组菌，在重组菌体内合成多种糖链数目和长度不同配比的多糖蛋白缀合物，进而开展O157多糖蛋白疫苗中糖链数目和长度最佳配比研究，为生产免疫效果最佳的多糖蛋白缀合物疫苗奠定基础。

多糖蛋白缀合疫苗占目前多糖疫苗的多数。目前多糖蛋白缀合疫苗生产多采用化学缀合方法，这一方法很难控制糖链和蛋白的结合，因此难以实现糖链结合数目及糖链长度最佳配比。本申请的目标在于试图通过生物法来实现这一目的。主要是以大肠杆菌O157:H7为例，利用细菌蛋白糖基化系统和细菌脂多糖（LPS）合成途径，通过对蛋白糖基化改造和宿主菌LPS 合成途径相关酶的研究及改造，构建重组菌，在重组菌体内合成多种糖链数目和长度不同配比的多糖蛋白缀合物，为生产免疫效果最佳的多糖蛋白缀合物疫苗奠定基础。本项目选用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)成为作为新的载体蛋白。经过基因分析，我们发现理论上突变的糖基化位点是133,178,303，341 位。结合晶体结构和其他的数据，我们对每个糖基化位点突变5 个氨基酸，共突变20 个氨基酸。同时在大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MBP C-末端插入4个连续的DQNAT。突变后的MBP被构建到结合有PglB的质粒上。构建好的载体转入BL21中进行表达。WESTERN 检测发现，和未改造MBP的相比，基因改造的MBP成功的被糖基化。一些研究初步表明，Wzz 可能会参与多糖糖链长度的控制。我们选用不同类型不同来源的Wzz，通过表达不同来源的Wzz，实现LPS的长度调节。大肠杆菌W3110被作为模式宿主。本实项目成功将E.coli W3110和O157:H7 中脂多糖(LPS)合成相关基因waaL敲除，并进行了验证。同时将大肠杆菌O157:H7的O－抗原合成基因簇转入宿主菌，实现模式宿主菌中特异O多糖的合成。把糖基化改造后的MBP和pglB分别重组到质粒上，转化到改造过的宿主菌中，构建好PglB的多糖-蛋白缀合疫苗平台, 对获得的糖-蛋白缀合物进行检测。免疫后动物的抗体滴度检测检测多糖蛋白缀合物疫苗的生物效果。结果MBP-PS能够激起小鼠产生较高的抗O157的IgG抗体。同时对不同多糖缀合疫苗性质分析和生物活性检测，确定不同载体蛋白及其不同位置多肽对糖缀合物疫苗抗多糖IgG 滴度和亚型的影响。