基于多药耐药相关蛋白MRP的游离蒽醌吸收机制研究

蒽醌是多味常用中药的药效成分，我们研究表明口服给药后，其多数吸收较差。多药耐药相关蛋白（MRP） 是肿瘤细胞外排药物导致耐药性形成的主要外流泵，也在胃肠道内皮细胞有较高表达，其底物多具酚羟基或苯环羧基。基于游离蒽醌结构特点，我们认为"游离蒽醌作为MRP的底物，其口服吸收受到相互间的MRP外排影响"。预试验表明大黄酸和大黄素确为MRP的底物。为进一步验证假说，拟采用在体肠灌流和Caco-2细胞培养实验，明确MRP是否外排其它三种游离蒽醌；同时由于P-糖蛋白（Pgp）底物的广泛性，也拟考察Pgp对其吸收的影响。在此基础上拟研究相关的酶促动力学和底物间的协同或竞争关系，并初步探明游离蒽醌与MRP相互作用的结构特点。由于蒽醌类显著的抗癌活性，近年来已成为广受关注的侯选药物对象。因此本研究不仅对明确多味常用中药口服吸收机制具有重要的理论和应用价值，也可为新型抗癌药物研究提供基础研究数据。

本项目应用大鼠单向在体肠灌流、Caco-2细胞双向转运为主要技术手段，评价了芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的吸收转运特征，并以维拉帕米或吲哚美辛为P-gp及MRP-2外排泵的干预试剂，比较了相应条件下表观渗透系数Papp的变化。同时，以autodock vina为工具，采用分子对接法分析了大黄中162种成分与P-gp晶体结构3G5U的配体受体结合能和结合方式。为进一步明确外排蛋白与蒽醌类化合物的结合机制，采用荧光猝灭法明确了芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚与牛血清白蛋白的结合常数、结合位点和结合作用力类型。在体和细胞转运实验结果表明：大黄酸属易吸收化合物，其余三种蒽醌类化合物属中等吸收化合物；四种化合物主要吸收区域为十二指肠等消化道上段，这可能同其化学结构的弱酸性有关。分子对接实验表明，大黄中多种蒽醌类原型化学成分与3G5U结合能与P-gp经典抑制剂维拉帕米等值相当，其中大黄主要成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸affinity值分别为-8.65、-8.24、-8.82、-8.02、-8.44，其中以大黄素和芦荟大黄素较强。荧光猝灭法表明芦荟大黄素和大黄素与蛋白质的相互作用力主要为静电作用力，而大黄酚主要为疏水作用力，结合方式具有明显差异性。综合分析各部份实验结果，认为芦荟大黄素吸收受到P-gp和MRP2的较弱影响，吸收较好；而大黄酸不受P-gp和MRP2外排的影响，吸收好，生物利用度高；大黄素和大黄酚吸收较差，同时受P-gp和MRP2外排影响，但其与外排泵间的作用力类型不同。同时观察到大黄酚稳定性相对较差，光解动力学研究表明，其溶液光照不稳定，质量减少过程近似一级动力学，半衰期约为197小时，并通过GC-MS方法确定了其两种光解产物为8位与6位氧化物。本研究明确了常见的四种蒽醌类化合物的吸收机制和及相关的外排泵，对促进相应中药口服吸收机制研究具有较高的理论和应用价值，也可为相应新型药物研究提供基础数据。