苹果自噬基因MdATG8i在缺氮胁迫中的生物学功能和互作蛋白分析

There is a common phenomenon with low nitrogen use efficiency (NUE) in apple orchards in our country. Nitrogen deficiency not only severely affects tree growth and fruit yield formation, but also causes a serious waste of fertilizer and soil deterioration. Autophagy in plants plays a very important role in both nitrogen utilization and remobilization processes under stress conditions, but its biological function is still not clear, especially that the research on autophagy in apple plants is still in a blank stage. Applicants previously cloned key autophagy gene family members of ATG8 from Golden Delicious, and found that MdATG8i transcript responsed to nitrogen starvation remarkably both in leaves and roots, and that the sequence of MdATG8i is special and studied less. Based on these, the project intends to analyze its transcriptional level, tissue expression, biological functions and its influence on NUE under nitrogen deficiency, by adopting molecular biology, genetic transformation and physiological and biochemical methods. We will also identify MdATG8i interacting proteins through yeast-two-hybrid screening and co-immunoprecipitation to unveil the functional mechanism under nitrogen deficiency. The results have important theoretical significance to resolve the biological function of autophagy in nitrogen deficiency stress, as well as potential application for apple germplasm with high NUE.

我国苹果园普遍存在氮素利用效率低下现象，不仅严重影响树体生长发育和果实产量形成，而且造成化肥的严重浪费和土壤恶化。自噬在逆境条件下植物合理利用氮素以及分配氮素过程中都发挥着非常重要的作用，但其生物学功能尚不清楚，特别是苹果中自噬的相关研究还处于空白阶段。申请者前期从金冠苹果中克隆了自噬关键基因ATG8的家族序列，并发现叶片和根系中的MdATG8i同时对氮饥饿响应显著，且该基因序列特殊，研究较少。在此基础上，本项目拟通过分子生物学、遗传转化和生理生化等手段，深入研究苹果自噬基因MdATG8i在缺氮胁迫下的转录水平、组织表达、生物学功能以及对氮素利用效率的影响，并通过酵母双杂交和免疫共沉淀等方法挖掘和鉴定苹果中与MdATG8i互作的蛋白，探明苹果氮饥饿胁迫下MdATG8i蛋白的作用机制。研究结果对解析自噬在缺氮胁迫中的生物学功能和高效用氮的苹果种质创新具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

中国是世界第一苹果生产大国，近年来苹果果园普遍存在氮素利用效率低下现象，不仅严重影响树体生长发育和果实产量形成,而且造成化肥的严重浪费和土壤恶化。自噬是真核生物体内保守的细胞生物学过程，是重要的蛋白质降解途径之一。逆境条件下，自噬在植物营养循环、氮素利用以及再分配过程中发挥着非常重要的作用，但其分子生物学机制尚不清楚，特别是在多年生苹果植物中关于自噬基因功能和调控的相关研究还处于空白阶段。本项目从金冠苹果中克隆了自噬关键基因ATG8的家族序列，转录表达分析发现叶片和根系中的MdATG8i同时对氮饥饿响应显著，且该基因序列特殊，研究较少。在此基础上，本项目通过分子细胞生物学、遗传转化和生理生化等手段，主要研究了苹果自噬基因MdATG8i在缺氮胁迫下的转录水平、亚细胞定位、启动子克隆及分析、转基因拟南芥的生长表型和营养胁迫抗性分析、转基因苹果愈伤组织的营养胁迫抗性分析、转基因嘎拉苹果组培苗的营养胁迫和腐烂病抗性分析，并通过酵母双杂交文库筛选方法挖掘了一些与MdATG8i互作的蛋白，并对感兴趣的几个互作蛋白进行了蛋白质相互作用的验证以及功能初步分析。主要研究结果发现：苹果MdATG8i在转录水平上可以被缺氮胁迫、氧化胁迫和衰老诱导上调表达；其启动子区域含有响应环境胁迫和生长发育激素响应的相关调控元件；拟南芥中过量表达该基因生长加快、开花提前、加速叶片衰老，但是提高了碳氮胁迫下的耐受性和长期饥饿后的生长恢复能力；过量表达该基因也提高了苹果愈伤组织碳氮胁迫下的抗性；过表达转基因嘎拉苹果组培苗提高了缺氮、低钾、缺糖、氧化胁迫和腐烂病侵染等抗性；MdATG8i互作蛋白的初步筛选验证以及部分基因功能分析为以后更深入的自噬在苹果中的特异性调控研究奠定了基础。这些结果为解析自噬关键基因MdATG8i在缺氮胁迫中的生物学功能和高效用氮的苹果种质创新提供了重要的理论基础，对提高果树氮素利用效率和产量及品质具有潜在的应用生产价值。