基于分子振动的免标记全脑神经网络成像的研究

Brain-wide neuronal network imaging with submicron spatial resolution has been relied on tedious and time consuming florescence labeling for decades. Label-free imaging technology based on intrinsic molecular vibration of bio-chemicals, such as Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy, is the new emerging frontier of biological imaging. It provides the realistic solution for label-free imaging of brain-wide neuronal networks with chemical specificity, and further enables study of brain structure, brain function and brain disease from a much fundamental basis, bio-molecules, but challenging. Here, we propose a method, which integrates SRS and Micro-optical sectioning tomography (MOST) for vibrational imaging of brain-wide connectome. This technology is capable of visualizing neurons, dendrites and axons by chemical identification and mapping three dimensional neuronal network of whole mouse brain, sectioned by MOST. Further studies of brain function and disease with molecular information by using this platform promise to give new insight into the impact of this methodology.

高分辨全脑神经网络成像的发展长期以来一直局限于对全脑样品的繁琐且耗时的荧光标记过程。基于探测细胞组织中固有化学分子振动的受激拉曼散射成像技术是目前生物学领域免标记成像的研究前沿和热点，是实现全脑神经网络无标记成像的解决方案，并能借助拉曼光谱从最基础的化学和分子层面对全脑结构、脑功能、脑疾病进行细致的研究。但目前不依赖于染色或蛋白荧光标记的全脑神经网络成像还没有先例。本项目拟研究和结合非线性相干受激拉曼散射显微成像技术与显微光学切片断层成像技术对未经染色标记处理的小鼠全脑神经网络进行分子振动成像。本项目将发展一种全新的全脑可视化方法，仅应用飞秒激光探测脑内神经元细胞及神经网络中固有化学分子的振动进行成像，融合精密切片技术以亚微米精度在全脑范围绘制高分辨三维神经网络分子图谱。在分子层面开展和探索脑功能、脑功能紊乱模型的研究。本项目的研究成果将对全脑网络的成像方法和变革产生重大影响。

一直以来，各种荧光标记和荧光显微镜技术是脑神经网络成像以及全脑可视化的首选方法。但基于荧光标记的成像方法存在着诸多问题，包括荧光标记过程繁琐复杂、深部脑区标记困难、荧光漂白、容易淬灭等。应用相干受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）方法对生物样品进行无标记的分子成像的方法越来越受到关注。SRS显微镜可以激发细胞和组织中固有生物分子产生分子振动实现高分辨免标记成像。但由于成像速度有限，还无法对大面积和大体积鼠脑样本进行快速三维亚微米分辨显微成像。在该项目中，我们研发了基于声光偏振器（Acousto-optic Deflector，AOD）进行无惯性激光扫描的SRS成像技术。应用该技术，我们在8分钟内实现12×8毫米大小脑片的高分辨显微成像，在12小时之内完成了整个小鼠鼠脑的SRS无标记显微成像。我们还应用单模保偏光纤中自相位调制特性发展了光谱压缩技术，将SRS光谱的分辨率提高到了4.9 cm-1。为了实现更高空间分辨率，我们发展了可见光波段的SRS成像，将脑片成像的空间分辨率提高到了130 nm。在该超高空间分辨率下，我们在脑片上成功解析出神经轴突髓鞘中鞘磷脂的拉曼峰。我们的研究工作为研究小鼠全脑神经网络提供了快速高分辨的无标记成像方案，同时拉曼指纹光谱为脑组织中生物代谢分子的空间分布提供了有力的化学成像方法。