玉米collapsed2 (opaque12)突变造成籽粒淀粉含量降低和胚乳粉质的分子机制研究

Starch and zein are the most important storage and the determinate factors of maize yield and quality. Maize classic mutant collapsed2 (cp2) is a low yield and starch endosperm mutant. Our previous results indicate that the starch and zein contents significantly are reduced in cp2 mutant and the number of amyloplast in endosperm and chloroplast in mesophyll cell are also reduced and the amyloplast can separate from each other. In this project we will clone the cp2 gene using map-based cloning combined with candidate gene sequencing analysis using several allelic mutants. We will use functional complementation, RNAi and over-expression to confirm the cp2 gene and analysis gene function. The cp2 expression pattern will be established by real-time PCR and Western blot, and the subcellular localization of Cp2 will also be done. We will perform the transcriptome and proteome analysis using next generation sequencing and DIGE and identify the interaction protein of Cp2 by Y2H to research the biological processes affected by Cp2. At last, we will analyse all of the data combined the phenotype analysis of cp2 mutant to dissolve the essence that cp2 mutant cause low yield and starch endosperm. These will be useful to increase maize yield and improve kernel quality by molecular breeding.

淀粉和醇溶蛋白是玉米籽粒中的主要储藏物质，是玉米产量和品质主要的决定因素。玉米经典突变体collapsed2（cp2）是一个影响玉米产量，造成粉质胚乳的突变体。我们的前期研究表明cp2突变体籽粒淀粉和醇溶蛋白含量显著降低，胚乳细胞中淀粉体以及叶肉细胞的叶绿体数目减少，其中淀粉体表现出几个淀粉体聚集在一起，彼此不能分离。本项目将利用图位克隆技术结合等位突变体测序克隆cp2基因，利用功能互补、RNAi和过量表达技术确认cp2基因和分析基因功能。通过定量PCR技术和Western技术建立cp2基因的表达模式并进行亚细胞定位。利用二代测序和DIGE技术分别对cp2突变体转录组和蛋白组分析，利用酵母双杂技术筛选与Cp2互作的蛋白，分析cp2参与或影响的生物学过程。结合cp2突变体的表型分析，揭示cp2造成籽粒淀粉含量下降和粉质胚乳的突变本质，为提高玉米产量与品质的分子育种与创新提供重要的理论指导。

作为全球第一大作物。玉米是保障我们粮食安全的重要作物，在我国国民经济中起着重要的作用。玉米籽粒是玉米的重要储藏器官，直接决定着玉米的产量和品质，一直是玉米基础研究和应用研究的重点和热点。collapsed2 （cp2）是一个较早被报道的有关玉米籽粒发育的经典突变体。. 相对于野生型相比cp2突变体籽粒中的淀粉含量显著降低，野生型籽粒中淀粉的含量可达到70.21%，而在cp2突变体427AB的籽粒中淀粉含量只有56.32%。而且cp2突变体籽粒的19，22，27和50kDa醇溶蛋白也有明显的下调。细胞学分析表明突变体中淀粉体和叶绿体的数目明显减少，体积增大，是由于突变体的细胞分裂正常而质体分裂受阻。 而突变体中蛋白体的数目减少，大小变小。我们利用图位克隆和等位突变体验证的方法确认了cp2突变体是由于GRMZM2G024563的突变，导致其功能丧失所致。其拟南芥的同源基因为crumped leaf （crl），其编码一个AAA-ATPase。CP2是一个组成型表达的基因，定位于淀粉体和叶绿体等质体的膜上。RNA测序分析表明，cp2突变体相对于野生型有大量的分布于各中生物学过程的众多路径的基因的表达发生了变化。尤其是在碳代谢、氨基酸合成、醇溶蛋白的合成和淀粉的合成和代谢方面的影响更为显著。利用定量RT-PCR在授粉后12天的籽粒中检测到在cp2突变体中淀粉合成酶基因和醇溶蛋白基因的表达都显著下调。这些基因表达的下调与cp2突变体中淀粉和醇溶蛋白含量下降是一致的。. CP2基因作为一个AAA-ATPase，其突变体在拟南芥中可以引起ROS反应，而细胞中的ROS反应能够阻碍细胞分裂。 叶绿体分裂的研究已经有较多报道，其分裂装置主要有FtsZ环、PD环和ARC5环构成，其中部分蛋白具有GTP酶或ATP酶的活性。我们初步的酵母双杂交筛选实验也表明CP2蛋白可能会结合一些跟逆境相关的因子，但是没有筛选到质体分裂蛋白。cp2突变体导致质体分裂受阻的具体机制将是后续研究的重点和难点。cp2突变体引起质体分裂受阻，进而导致众多核基因表达的变化，引起淀粉和醇溶蛋白合成减少的研究以前报道较少，本研究结果丰富了玉米籽粒淀粉和醇溶蛋白的调控方式，为籽粒发育的遗传改良提供了新的理论基础，同时也为质体向细胞核的逆向信号传递的提供了新的遗传材料和线索。