芳氧苯氧丙酸酯类除草剂精噁唑禾草灵微生物降解途径及分子机制

Fenoxaprop-ethyl{ethyl-2-[4-[(6-chloro-2-benzoxazolyl)oxy] phenoxy] propanoate]} (FE) is a postemergence applied aryloxyphenoxy propionate (AOPP) herbicide used for the control of annual and perennial weeds in crops. The large amount of FE is used every year. The residues of Fenoxaprop-ethyl in soil and water pose a threat to ecological balance and our health. Microbial degradation is considered as a good method to eliminate pesticide residues. However, there are only several reports about this process and molecular basis.Previously, a FE-degrading consortium W1 was isolated by enrichment from the FE polluted soil. FE-degrading bacteria strain Rhodococcus sp. T1，Acinetobacter sp. DL-2 and Pigmentiphaga sp. DL-8 were progressively isolated from the consortium W1, a preliminary degradation pathway was identified. Further investigation seeks to (1) indentify the entire metabolic pathway of FE by consortium W1; (2) clone the genes involved in the degradation of FE and clarify the functions of these genes, mapping FE-degradation gene (cluster) structure; (3) reveal the molecular mechanism of the key enzymes involved in FE-degrading pathway. The results of this program will provide physiological, biochemical and genetic foundation of microbial degradation of FE in environment.

精噁唑禾草灵是我国使用量最大的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂之一,广泛用于防除禾本科杂草的芽后防除。因大量使用而在水体、土壤中的残留对生态平衡和人体健康构成威胁。微生物降解是其重要的环境行为，但目前对其降解机制的了解还不透彻。前期工作中项目组从污染土壤中富集到一组降解精噁唑禾草灵的微生物群落W1，从中分离到联合降解菌株Rhodococcus sp. T1，Acinetobacter sp. DL-2 及Pigmentiphaga sp. DL-8,并初步分析了其降解途径。本项目拟通过分析化学及分子生物学手段进一步阐明①精噁唑禾草灵微生物降解的完整途径;②菌株 T1， DL-2和 DL-8联合降解精噁唑禾草灵的一系列功能基因,绘制精噁唑禾草灵降解基因（簇）的结构图谱;③从生物化学和分子生物学水平上揭示精噁唑禾草灵降解关键酶的酶学特性。预期结果将为精噁唑禾草灵残留微生物(酶)生物修复技术打下基础。

精噁唑禾草灵是我国使用量最大的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂之一,本项目对其微生物降解机制进行了研究。. 本项目主要研究内容包括：1）利用HPLC和MS/MS鉴定了菌群W1降解FE过程中的主要代谢产物精噁唑禾草灵酸(FA)、6-氯苯并噁唑酮(CDHB)、对羟基苯氧丙酸(HPP)和2-氨基-5-氯苯酚（2A5CP），菌群W1亦可以利用上述代谢产物作为唯一碳源生长，模拟了FE被微生物菌群W1降解的上游代谢过程。. 从菌群W1中分离到一株可以利用CDHB或HPP作为唯一碳源生长的菌株DL-8，利用HPLC-MS鉴定了CDHB代谢中间体2A5CP，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Butyl-650M疏水层析等蛋白质纯化手段，从Pigmentiphaga sp. DL-8中将CDHB水解酶CbaA纯化。构建表达菌株E.coli BL21(DE3-pET-cbaA)，经诱导培养后，实现重组酶CbaA在E.coli BL21中的异源表达，HPLC检测重组菌株静息细胞转化CDHB的产物为2A5CP。利用单交换同源重组的手段对Pigmentiphaga sp.DL-8中的cbaA基因进行沉默，突变菌株丧失了降解CDHB的能力，进一步验证了cbaA在CDHB降解中的重要性。. 通过 HPLC/MS 分析，鉴定了菌株DL-8代谢HPP的两个中间产物对苯二酚和偏苯三酚。结合基因组扫描和生物信息学分析，对预测的两个关键编码基因orf3747,orf5367进行了克隆，静息细胞转化的结果验证了该基因的功能。