玉米Opaque1突变造成胚乳粉质的分子机制研究

籽粒的密度和硬度是决定玉米产量和品质的重要性状。玉米粉质胚乳突变体是研究该性状的重要资源。目前，玉米胚乳粉质突变造成籽粒密度和硬度降低的分子机制还不清楚。玉米经典突变体opaque1在形成粉质籽粒的机制上明显区别于其它因影响储藏蛋白合成或积累所形成的粉质胚乳突变体，对揭示决定籽粒硬度的分子机制具有重要研究价值。利用图位克隆技术克隆了Opaque1基因。本申请在此基础上，利用功能互补突变表型、模式物种同源基因突变体、RNAi及过量表达解析O1功能。同时，通过定量PCR建立其表达模式，并进行表达组织定位。利用酵母双杂交筛选与O1互作的蛋白，整合转录水平的分析结果，确定O1参与或影响的生物学过程。最后，结合O1突变体的表型分析，揭示opaque1胚乳粉质突变的本质，阐述决定玉米籽粒硬度的分子机制。

玉米是人类粮食、动物饲料、工业原料和生物能源等的主要来源。玉米中存在一种胚乳柔软粉质不透明的突变，称为opaque突变。与正常籽粒相比，大多数opaque突变体的赖氨酸含量显著增加。因此，对此类突变体的研究有助于解析籽粒密度和硬度的决定机制，通过基因工程手段改良玉米的蛋白品质和提高产量。.opaque1是一个经典玉米籽粒胚乳粉质突变体。与野生型相比，o1成熟籽粒中的总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白均没有显著变化；在发育的胚乳细胞中，o1突变体的蛋白体变小变多，且内质网发生膨大。利用图位克隆获得了O1基因，其全长约30kb，编码植物特有的XI型肌球蛋白（myosin XI），包含头部（Head）、颈部（Neck）和尾部（Tail）保守的结构域。野生型和突变体发育的籽粒中，醇溶蛋白的合成和积累均没有明显差异。在烟草中表达eYFP-O1-tail融合蛋白，发现O1从细胞质到核膜上均有定位；且有时定位信号为点状，有时呈弥散状。亚细胞组分分离和Western杂交发现，O1在内质网和蛋白体上均有分布且主要分布于内质网的膜中。酵母双杂交结果表明O1不能和与玉米中可能参与管状内质网形成的相关蛋白互作，也不能与蛋白体的固在蛋白（醇溶蛋白、FL1）互作，表明O1可能不直接参与蛋白体的装配。同时，在转录和翻译水平上检测内质网胁迫的感知基因（ER stress sensors）发现，o1突变体中不存在明显地非蛋白折叠效应（UPR，unfolded protein response）。在烟草叶片表皮铺列细胞（pavement cell）中通过显著性抑制（dominant negative）分析发现，过量表达O1的尾部结构域能够显著地抑制内质网的运动。为了鉴定O1与内质网相互作用的介导蛋白（adaptor），利用O1与货物结合的尾部结构域筛选获得了一个候选蛋白HIP。HIP是一个HSP70互作蛋白，包括3个保守的结构域TPR、DnaJ和PB1。酵母双杂交结果验证了HIP可以和O1互作。同时，亚细胞定位显示HIP与内质网共定位。BiFC检测表明，O1尾部也可以和HIP尾部在洋葱表皮细胞中互作。表明HIP可能是联系O1与内质网的介导蛋白。 因此，O1通过调控内质网的运动和形态影响蛋白体的装配。