双脂肪酶表面展示型全细胞催化剂构建及其催化木本油脂转酯化作用

全细胞催化是现代生物催化技术的重要发展方向，表面展示型全细胞催化剂是生物柴油等许多领域的热点研究。但迄今为止，对双脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂构建及其催化木本油脂转酯化，国内外尚无研究报道。本项目研究结合基因工程技术和细胞表面工程技术，通过克隆并筛选适宜的锚定蛋白基因，以性能优异并具协同作用的米根霉脂肪酶（ROL）和南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）为表面共展示目的蛋白，将两种脂肪酶基因分别与锚定蛋白基因融合再转化到毕赤酵母中，构建具有同时表达两种目的脂肪酶且可自行固定在细胞表面的重组脂肪酶基因工程菌，探讨其作为新型全细胞催化剂对木本油脂麻疯树和黄连木油脂的催化转酯化作用。同时，针对脂肪酶细胞表面展示量检测存在的问题，采用X-射线光电子能谱法（XPS）对脂肪酶在细胞表面的展示量进行定量表征，建立脂肪酶细胞表面展示定量分析方法。项目研究具有重要的科学意义及理论和应用价值。

1. 项目背景. 全细胞催化是现代生物催化技术的重要发展方向，表面展示型全细胞催化剂是生物柴油等许多领域的热点研究。但迄今为止，对双脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂构建及其催化木本油脂转酯化，国内外尚无研究报道。本项目研究旨在构建具有同时表达两种目的脂肪酶且可自行固定在细胞表面的重组脂肪酶基因工程菌，探讨其作为新型全细胞催化剂对木本油脂麻疯树和黄连木油脂的催化转酯化作用。.2. 主要研究内容.（1）锚定蛋白基因的克隆及筛选. 由富含多种细胞壁结合蛋白的酿酒酵母中提取基因组、采用PCR 技术克隆了包括Flo1、Pir1 及Sed1p在内的多种细胞壁蛋白基因作为锚定蛋白基因，研究比较了不同锚定蛋白对脂肪酶的展示效果。.（2）基因融合方式选择与表达质粒优化. 根据锚定蛋白基因的类型，选择相应的融合位点、C 端或N 端连接方式，探讨了不同锚定方式对表面展示脂肪酶结构、活性和稳定性的影响规律，构建了高效脂肪酶表面展示表达质粒。.（3）脂肪酶表面共展示重组基因工程菌的构建. 在构建高效表达质粒的基础上，以毕赤酵母为宿主菌，采用电转化将构建的两种脂肪酶表达质粒分别导入到相同酵母细胞中进行分泌表达，实现了米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B 在细胞表面的共展示。.（4）脂肪酶细胞表面展示量的表征. 采用激光共聚焦显微镜（LSCM）、Western Blot 以及流式细胞仪等方法确认脂肪酶成功固定在毕赤酵母细胞表面，并利用Western Blot和流式细胞仪测定了脂肪酶在细胞表面的展示情况。.（5）重组脂肪酶基因工程菌的高密度培养及脂肪酶诱导表达.对获得的双脂肪酶细胞表面共展示重组基因工程菌进行了细胞高密度培养及脂肪酶诱导表达研究，成功制备了脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂。.3. 重要结果及关键数据.（1）以毕赤酵母为载体成功构建了一种米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B 细胞表面共展示型高效重组脂肪酶基因工程菌，其脂肪酶酶活达到680U/g细胞以上；.（2）通过细胞高密度培养及脂肪酶诱导表达研究，获得最适培养及诱导表达条件；以构建的双脂肪酶表面共展示型全细胞催化剂催化油脂转酯化，脂肪酸甲酯得率达到95%以上；.（4）研究成果发表论文10篇，其中SCI收录论文7篇，获授权发明专利1项、申请发明专利4项。