以Ac/Ds转座子系统克隆和分析玉米籽粒发育相关基因

玉米是重要的粮食作物和能源作物。籽粒作为玉米的重要的储藏器官，一直是玉米基础和应用研究的重点。相对于玉米籽粒发育的复杂过程，目前已经开展详细研究的基因还很少。玉米内源的转座子系统，如Mutator和Ac/Ds系统等，是目前克隆玉米新基因和开展功能基因研究的最主要手段。我们在前期的研究中已建立了自己的Ac/Ds突变体系，获得了180个遗传粗定位的新Ac转座系，并从中鉴定了10个具有可靠的籽粒单基因突变表型的Ac转座系。本研究将针对这10个籽粒突变体，通过Ac转座子标签的分离，克隆相应的Ac插入基因。并对其中的部分基因进行相应的基因表达分析和初步的功能鉴定，为玉米籽粒发育的研究提供新的信息，为玉米产量的提高提供新的分子设计基础。

在基础理论和实际应用方面，玉米籽粒都是重要的研究对象。插入突变研究是克隆和分析基因功能的一个有效的方法。在玉米中，主要是利用Mutator和Ac/Ds转座子进行插入突变研究。.利用基于Southern杂交和反向PCR的方法我们在5个dek突变体中获得了Ac的侧翼序列，并且利用PCR方法鉴定了这些序列确实为Ac的侧翼序列。但是共分离分析表明这些侧翼序列并不与dek表型呈现共分离。.为了增加获得与Ac共分离的突变体的机率，我们创建了一个高效的转座突变系统 apt1-m1(Ac)。利用这个系统获得转座插入突变体的频率可达9%，远高于利用Ac负剂量效应的2-4% 的频率。我们获得近10000个转座插入事件，并且繁殖获得了2500多个转座插入突变系。同时我们利用su1::Ac转座系统创建了1000多份远距离的转座系。在这些转座系中鉴定到了36份具有dek突变表型的转座系。这些突变体为玉米籽粒发育的研究提供了新的材料。.我们建立了基于Genomewalking技术的分离Ac/Ds转座子侧翼序列的PCR方法。这种方法相对于基于Southern杂交和反向PCR技术的方法，大大降低了实验难度，提高了Ac/Ds侧翼序列的分离效率。利用这种方法，在230多份转座系中分离到了Ac/Ds的侧翼序列。这些Ac/Ds转座子可以作为新的起始位点用于创建新的转座事件，而且可以用于定向突变基因。.通过细胞学分析我们明确了shu00067为糊粉层缺失的突变体，而且胚的发育严重滞后，而shu00074为胚畸形发育的突变体。我们利用基于Genomewalking技术的PCR方法，在shu00067突变体的分离群体中鉴定到一条与dek表型共分离的条带，通过测序分析表明是一个Ds插入到玉米的GRMZM2G351454基因。同时我们通过图位克隆方法，将shu00067定位到了1个170Kb的区间内，该区间内有6个在玉米和水稻中存在微观共线性的基因，其中就包括了基因GRMZM2G351454。通过检测区间内6个基因的转录情况，其中只有基因GRMZM2G351454在突变体中没有检测到转录物，而其它基因可以正常转录。综合上述的转座子标签法和图位克隆获得的结果我们确定了基因GRMZM2G351454的一个Ds插入事件是引物Shu00067的dek突变表型的原因。GRMZM2G351454编码一个APO（Accu