COPII衣被蛋白Sec24磷酸化调控COPII囊泡-自噬隔离膜互作和自噬体形成的机制

ER-derived COPII vesicles have been proposed to be membrane source for isolation membrane (IM) and autophagosome formation during nutrient starvation. The mechanism of the interaction between COPII vesicles and autophagic membranes is not clear. It has been reported in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae., ER exit site, a specialized domain of ER where COPII vesicles are formed, is associated with the edge of IM where the autophagy related transmembrane protein Atg9 is localized. Our preliminary data showed the phosphorylation of the membrane-distal surface of the COPII coat protein Sec24 by Hrr25 kinase facilitates the interaction of Sec24 with Atg9 to regulate the abundance of autophagosomes during starvation. Phosphorylation of Sec24 is specifically required for macroautophagy, but not ER-Golgi transport. In Sec24 T324A/T325A/T328A mutant which can’t be phosphorylated by Hrr25，Sec24-Atg9 interaction and IM formation are affected while ER-Golgi transport is essentially normal. To test the hypothesis that phosphorylation of Sec24 by Hrr25 facilitates the Sec24-Atg9 binding and COPII-IM interaction, a variety of approaches including super-resolution SIM microscropy、electron microscropy、live cell imaging and autoradiography will be used to explore the interaction between COPII vesicles and isolation membrane and determine the role of Sec24 phosphorylation in this process. In vitro reconstitution will also be used to identify precise molecular mechanisms involved in the COPII-IM interaction. Our studies will facilitate the detailed mechanistic understanding of interaction between COPII vesicles and autophagic membrane structure and provide information for generating membranous structure interactome maps.

ER来源的COPII囊泡是自噬隔离膜（IM）和自噬体形成的膜来源之一，但其与自噬相关膜结构互作机制尚不清楚。已有文献报道酵母ER上形成COPII囊泡的区域（ERES）紧邻新月形IM尖端，此处恰为自噬关键跨膜蛋白Atg9在IM上的定位位点。我们前期研究证明衣被蛋白Sec24磷酸化调控COPII囊泡由ER-Golgi运输向自噬通路分流，并促进Sec24-Atg9结合。不能被磷酸化的突变体中，Sec24-Atg9结合和IM形成受阻，但ER-Golgi运输不受影响。故推测：Hrr25通过磷酸化Sec24，调控Sec24-Atg9结合，介导COPII囊泡与IM互作，促进IM形成和延伸。我们将以酵母为模型，综合运用超高分辨率显微成像、电镜、活细胞成像等技术，阐明COPII-IM互作模式、分子基础和对自噬体形成的影响，并探索利用体外重构系统模拟互作过程，从而验证假说并为绘制膜性结构互作网络图谱提供信息。

源自内质网的COPII囊泡作为膜来源在自噬隔离膜（isolation menbrane）和自噬体（autophagosome）形成中起重要作用，但其与自噬相关膜结构互作机制尚不清楚。我们前期研究提示在酿酒酵母中Hrr25激酶及其介导的COPII囊泡衣被蛋白Sec24磷酸化在此过程中起重要作用。为了解析Hrr25和Sec24在COPII-自噬相关膜结构-内质网互作中的作用，我们首先利用同位素标记的COPII囊泡，分离纯化同时携带Atg9和Atg8的自噬相关膜结构，检测自噬相关膜结构上的同位素信号，发现自噬相关膜结构上的放射性活性显著高于对照膜结构，提示COPII囊泡与自噬膜结构互作，直接为自噬体供膜。利用Sec24磷酸化突变体和Hrr25激酶的突变体确定Sec24磷酸化修饰和Hrr25激酶在COPII与自噬膜结构互作过程中起关键作用。为了验证这一现象的保守性，我们在哺乳动物细胞中检测了Hrr25同源蛋白CK1δ和SEC24四种亚型（SEC24A，SEC24B， SEC24C，SEC24D）在巨自噬中的作用，发现CK1δ和两种SEC24亚型（SEC24A,SEC24D）参与于自噬体形成过程，且均作用于早期阶段。随后在酿酒酵母中筛选鉴定了与Sec24磷酸化相关的其他调控因子，明确了Pbs2激酶、Ypt1、TRAPPIII 复合物在Sec24磷酸化过程中的重要作用。我们通过高分辨率荧光显微镜观察COPII、自噬相关膜结构、内质网互作过程中的膜系统的精细结构，发现Hrr25激酶在自噬体闭合、自噬隔离膜与内质网的互作过程中也起重要作用，部分Hrr25激酶的突变体会阻断自噬隔离膜闭合的过程，导致自噬隔离膜与内质网解离障碍，且此作用不依赖于Sec24磷酸化，提示有其他Hrr25激酶底物调控此过程。在此基础上我们筛选鉴定了调控自噬体闭合、自噬隔离膜与内质网互作的Hrr25/ CK1δ新底物，发现在哺乳动物细胞中，Hrr25的同源蛋白CK1δ激酶能够磷酸化SNARE蛋白STX13，并通过STX13调控自噬体闭合、自噬隔离膜与内质网的互作。在酿酒酵母中STX13没有同源蛋白，我们通过质谱鉴定和体内外结合实验鉴定了可能的底物蛋白septin和COG复合物，后续将继续鉴定具体的磷酸化位点并进行功能性研究。