水稻胚乳特异转录因子OsNAC26调控淀粉合成的分子机制

Starch is the important storage material of rice seed, and its composition and structure determine the appearance and eating quality. To date, the molecular mechanisms in regulation of starch synthesis in rice endosperm are largely unknown. In previous study, the applicant screened nine NAC family transcription factors that are specifically expressed in rice endosperm. Using CRISPR/Cas9 genome editing approach, we generated the mutants that are mutated in three highly expressed NAC genes. One of osnac26 mutant showed a floury opaque seed phenotype, indicative of endosperm development defect. Results of semi-thin section and apparent amylose content found that starch composition and molecular structure were altered in osnac26 mutant. Based on these results, in the present project, we will perform GPC and HPAEC to detect true amylose content and amylopectin chain length of starch in osnac26, and identify the OsNAC26-dependent regulation of gene expression by analyzing the transcriptome in endosperm between wild type and mutant. Then, we will use ChIP-Seq and -PCR to validate the direct target genes by OsNAC26. In addition, we will compare activity of the starch synthesis-related enzymes between wild type and osnac26, and study the potential mechanism affected by OsNAC26. Taken together, the project will reveal a molecular mechanism of OsNAC26-dependent regulation of starch synthesis in rice endosperm.

淀粉是水稻贮藏物质中的重要成分，其组成和结构决定了稻米的外观和食味品质。迄今，稻米胚乳中淀粉合成的分子调控机制还知之甚少。申请人前期研究筛选到9个胚乳中特异表达的NAC转录因子，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建了三个表达量最高NAC基因的突变体，其中osnac26突变体种子呈粉质胚乳表型；半薄切片及表观直链淀粉含量测定结果表明osnac26的淀粉分子结构发生改变。在此基础上，本项目拟利用GPC和HPAEC测定osnac26淀粉的真实直链淀粉含量和支链淀粉的链长分布；再利用胚乳组织的转录组测序，分析突变体中表达受影响的基因；然后利用ChIP-seq和-PCR验证OsNAC26直接对下游关键基因表达的调控。此外，利用酶活实验比较野生型和突变体中参与淀粉合成相关酶的活性变化，并验证OsNAC26对相关酶活影响的机制。最终揭示水稻OsNAC26调控胚乳淀粉合成的分子机制。

淀粉和贮藏蛋白是稻米中两种重要的营养物质，其含量分别占水稻胚乳干重的80%和10%以上。尽管淀粉和贮藏蛋白的合成机制已经研究得较为清楚，但其调控机制的研究仍然有限。本文研究了水稻中两个高度同源的NAC家族转录因子OsNAC20和OsNAC26在胚乳淀粉和贮藏蛋白合成调控中的作用。主要研究结果如下：.1、OsNAC20与OsNAC26序列相似性达到85%以上。它们不仅在胚乳细胞核中表达，也在胚细胞核中表达。OsNAC20和OsNAC26既可以形成同源二聚体也可以形成异源二聚体。这两个基因的单突变对水稻籽粒无显著影响，但同时突变导致籽粒呈现粉质籽粒表型，籽粒粒重降低，淀粉和贮藏蛋白含量显著降低。.2、多个淀粉和贮藏蛋白合成相关酶基因的表达均出现下调。淀粉含量的降低主要是由于SBEI、SSI、Pul和DPE1蛋白的含量或者活性降低降低引起，贮藏蛋白含量的降低主要是由于GluA1、GluB4、α-globulin和16 kDa prolamin蛋白的降低引起的。.3、本研究选取了AGPS2b、AGPL2、SBEI、SSI、Pul、GluA1、GluB4、α-globulin、16 kDa prolamin和DPE1基因，以进一步研究OsNAC20和OsNAC26是否能够直接调控它们的表达。双荧光素酶报告分析实验结果证实单独的OsNAC20或OsNAC26可以有效启动前9个基因的表达，但它们不能直接调控DPE1的表达。.4、启动子预测结果显示AGPL2、 SSI、SBEI、Pul、GluB4/5和16 kD prolamin 的启动子区域含有ACGCAA模体，但AGPS2b、GluA1和α-globulin不含有此模体。随机选取SBEI、16 kDa prolamin和AGPS2b 基因以进一步揭示OsNAC20和OsNAC26与靶基因启动子的核心结合位点。EMSA实验结果显示OsNAC20与OsNAC26可以与SBEI和16 kDa prolamin启动子区域的ACGCAA模体结合。进一步截短的启动子实验表明OsNAC20与OsNAC26可以与AGPS2b启动子区域的CCGTG模体结合。.本研究发现OsNAC20和OsNAC26直接地、冗余地调控淀粉和贮藏蛋白的合成。该研究结果将进一步充实淀粉合成的调控网络，增加人们对淀粉合成调控的认知，为稻米的品质改良提供强有力的理论支撑