UGTPqs基因在达玛烷型人参皂苷生物合成中的功能和催化机理研究

The glycosyltransferase (UGT), which is directly involved in the biosynthesis of monomer saponins, plays a key role in the dammarane-type ginsenoside biosynthetic pathway, but its gene function is unclear, leading to the fact that most of the dammarane-type saponins synthesis pathway has not been resolved. In previous study, we predicted two UGT candidate genes (UGTPq1 and UGTPq2) related to the biosynthesis of dammarane-type ginsenosides. We further revealed the biosynthesis of dammarane-type ginsenosides through the studies of the function of UGTPqs. Specific studies cover four areas: (1) UGTPqs genes will be cloned through searching transcriptome database that established by our group; (2) The gene function of UGTPqs will be verified through Saccharomyces cerevisiae cells in vitro transformation experiment; (3) The gene function of UGTPqs will be verified by the in vitro enzyme activity of Escherichia coli; (4) The gene function of UGTPqs will be verified by RNAi technology. (5) Construction of UGTPqs site-directed mutant expression vector, clearing UGTPqs protein catalytic mechanism. After the above researches, it is expected to further reveal the biosynthesis of dammarane-type ginsenoside, which is the basis for the large-scale biosynthesis of dammarane-type ginsenosides.

糖基转移酶（UGT）在达玛烷型人参皂苷生物合成中起着关键作用，但其基因功能尚不清楚，导致大部分达玛烷型单体皂苷合成途径尚未解析。我们前期研究预测到与达玛烷型人参皂苷生物合成相关的两个UGT基因UGTPq1和UGTPq2，据此提出通过UGTPqs（UGTPq1和UGTPq2）基因功能的研究，进一步揭示达玛烷型人参皂苷生物合成规律。具体研究内容涵括五个方面：（1）根据本课题组建立的转录组数据库，克隆获得2个UGTPqs基因；（2）通过酿酒酵母细胞的体外转化实验，验证UGTPqs基因功能；（3）通过大肠杆菌体外酶活实验，验证UGTPqs基因功能；（4）通过RNAi基因干扰技术，验证UGTPqs基因功能；（5）构建UGTPqs的定点突变表达载体，明确UGTPqs蛋白催化机制。本研究有望进一步揭示达玛烷型人参皂苷生物合成规律，为大规模生物合成达玛烷型人参皂苷奠定基础。

在达玛烷型人参皂苷生物合成过程中，关键酶糖基转移酶（UGT）直接参与单体皂苷生物合成，但其基因功能尚不清楚，导致大部分达玛烷型单体皂苷合成途径尚未解析。本项目通过基因初步筛选，锁定UGTPg71A29具有潜在的催化功能；通过体内体外验证实验揭示了UGTPg71A29的基因功能，并利用同源建模等方法研究了UGTPg71A29的催化机理。实验发现UGTPg71A29可以催化Rh1的20位糖基化形成Rg1，也可以催化Rd糖基化形成Rb1。在植物细胞中过量表达UGTPg71A29可以提高Rg1和Rb1含量，分别是对照细胞的3.2倍和3.5倍。同源建模、分子动力学以及突变分析发现283位谷氨酰胺是UGTPg71A29的关键催化位点。以上研究为通过生物技术生产人参皂苷奠定了基础，为其他三萜类皂苷生物合成提供参考，对保护中药资源，实现人参的可持续利用具有重要意义。