定位到自噬体膜上的SNARE蛋白对自噬调控机制的研究

Previous studies showed that the formation of autophagosome is accompanied with the membrane fusion. SNAREs family proteins are universally accepted as the important regulatory factors getting involved in the membrane fusion process. Most known SNAREs influence the autophagy in an indirect way. Yet in our study we try to find the SNARE proteins directly located on the phagophore or autophagosome membrane and regulating the autophagy. In the preliminary experiment we screened seven SNAREs which co-localize with Atg8, the marker of autophagosome, and regulate the autophagy process. After deleting five non-essential genes separately of seven SNAREs we found that the autophagy activity was reduced or completely blocked. We consequently detected the v-SNARE protein A which got involved in the regulation to autophagy and was never reported before in previous studies. We further found that the SNAREs was responsible for the transportation regulation from Atg9 vesicle to PAS. But we did not understand how the v-SNARE is located on phagophore or autophagosome membrane, what role the v-SNAREs play during the transportation from Atg9 vesicle to PAS and which t-SNARE coordinates with A to control the formation of autophagosome protein. In this study we would focus on discovering the molecular regulation mechanism of protein A on the formation of autophagosome, hoping to gain better understanding to the mechanism of membrane fusion during autophagy.

研究表明，自噬体的形成需要经历膜融合过程。SNARE家族蛋白作为膜融合的重要调控因子已被报道参与自噬过程，但大多数已知的SNARE蛋白对自噬的调控是一个间接过程。本研究中我们试图寻找直接定位到自噬体膜上调控自噬的SNARE蛋白。通过预实验，我们筛选到7个与自噬体膜存在共定位的SNARE蛋白，在分别敲除其中5个非必需基因后自噬活性降低或被阻断。由此找到一个从未被报道参与调控自噬过程的v-SNARE蛋白A。通过荧光显微镜发现该SNARE蛋白负责调控Atg9囊泡到PAS的运输过程。但这个v-SNARE是如何定位到自噬体膜上，又在Atg9到PAS的运输中发挥什么样的作用以及哪些t-SNARE蛋白与A蛋白协同调控自噬体的形成过程等系列问题尚待明确。我们将在本项目中着重揭示A蛋白对自噬体形成的分子调控，并试图解答上述问题，以期更好的帮助我们理解自噬过程中的膜融合机制。

自噬作为维持细胞稳态的重要信号通路，其功能性障碍与人类疾病息息相关。但是，目前对于自噬体膜成分的重排及膜融合相关知识了解还不是很透彻。SNARE蛋白作为重要的膜融合调控因子被报道参与自噬途径。其中大多数SNARE蛋白并非是作用在自噬体膜上，而是通过影响内吞或胞吐等细胞内其它运输途径，间接调控自噬体的形成。弄清楚哪些SNARE蛋白直接定位到自噬体膜上发挥功能，可以帮助我们更好的理解自噬的分子机制，为治疗自噬相关的疾病提供了一定的理论依据。.在本项研究中，我们通过荧光显微镜观察酿酒酵母中24个SNARE蛋白与自噬标志蛋白Atg8共定位的情况，确定了1个全新的定位到自噬体膜上v-SNARE蛋白A。该蛋白失活后，自噬活性降低。在酵母细胞中还存在A蛋白的同源蛋白A’，A’蛋白单独失活不影响自噬，当与A蛋白同时失活自噬活性降至最低。这说明A’蛋白也参与自噬的调控。通过遗传筛选，我们发现Atg6影响A蛋白的定位，在atg6Δ菌株中，A蛋白由多点状信号变成模糊的片团结构。此外，我们还检测了A和A’蛋白对自噬蛋白定位的影响，发现当这两个蛋白失活后使得Atg23从多点状分布变为一个亮点。为了检测Atg23定位的变化，我们通过系统的交叉比较和量化，开发了一套含有GFP、RFP、BFP三色荧光标记的、迄今为止最完善的酵母中使用的细胞器标记系统。利用开发的系统，我们发现Atg23亮点不与已知的细胞器标记蛋白共定位。这意味着Atg23亮点可能是未知的细胞结构，这需要我们接下来进一步研究。这些研究将加深人们对自噬体膜融合机制的理解，为自噬研究提供新的线索。