nik基因影响mcr-1基因表达和传播的作用及机制研究

The discovery of the plasmid-mediated colistin resistance gene mcr-1, enriched the theory of antimicrobial resistance mechanisms, but also threatened the value and significance of “polymyxins are the last-resort antibiotic for clinical treatment option”. Studies have identified that the nik genes have linked with mcr-1 and formed a novel genetic element. This genetic element have been found in various bacteria species. Previous researches have been proved that nik genes encode the relaxase proteins, which are considered to be essential for plasmid conjugation and disrupting antibiotic resistance propagation. However, the function and mechanism of nik genes affecting the expression and transmission of mcr-1 gene has not been identified yet. In this project, the gene knockout, RT-qPCR, Western blot and plasmid transfer experiments will be carried out to characterize the regulation of nik genes on the mcr-1 gene expression and plasmid transmission. At the same time, the bioinformatics analysis, clonal transfer expression, enzyme kinetic analysis and protein crystal structure prediction technology will be employed; then the results of phenotypic, molecular experiments and bioinformatics will be combined to elucidate the mechanism of the function of nik genes. This study results will provide a theoretical basis for assessing the risk of mcr-1 resistance gene spread in food-producing animals and studying the survival mode of drug-resistant bacteria, preventing and controlling the spreading of polymyxin resistant bacteria.

由质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1的发现丰富了耐药性形成理论，但也严重削弱了“多黏菌素作为临床治疗的最后一道防线”的价值和意义。研究发现nik基因在质粒上与mcr-1基因直接相连，形成独特的基因结构，且分布广泛。nik基因所编码的松弛酶，被认为是质粒接合转移的关键，并可干扰抗生素耐药繁衍。但目前nik基因在mcr-1基因表达和转移播散中的作用及机制尚不清楚。因此，本项目拟通过对nik基因进行敲除和回补，采用RT-qPCR、Western blot、转移实验等方法，探讨nik基因对mcr-1基因表达和传播的影响；同时，运用生物信息学分析、克隆转移表达、酶学分析和蛋白晶体结构预测等技术，综合表型实验、分子实验和生物信息学等的结果，阐明nik基因发挥作用的机制。本研究成果将为评估mcr-1耐药基因在食源性动物中的传播风险、深入研究耐药菌的存活方式、预防和控制多黏菌素耐药菌的传播提供理论依据。

多黏菌素类抗生素属于阳离子多肽抗生素，作为动物促生长剂在我国养殖业上的应用可以追溯到上世纪80年代，并且被认为是治疗泛耐药革兰氏阴性菌引起严重感染的“最后一道防线”。但是，随着由质粒介导的可水平转移的多黏菌素耐药基因mcr-1的发现，MCR类多黏菌素耐药基因在全球广泛传播给临床治疗和公共卫生带来巨大的挑战。本研究包括下述内容： 1）2018年至2019年陆续从河北、河南、四川和陕西省收集猪粪便、零售食品和病人粪便样品共847份，检测出135株mcr-1基因阳性大肠杆菌，其中猪粪便中阳性菌株的检出率高达54.6%。2）药敏试验结果显示，绝大多数mcr阳性菌株对3类或3类以上抗生素耐药，多重耐药性十分严峻。3）通过PFGE和MLST对菌株进行分子分型发现，PFGE聚类图谱显示菌株遗传具有多样性，并没有绝对优势的PFGE谱型。MLST分型分析发现ST1716、ST10是主要优势序列型别，MLST分型结果表明从不同样品中检出的菌株在分型上具有极大的多样性。4）除接合性质粒以外，插入序列ISApl1是分布最广泛，同时也是被研究最多的mcr-1侧翼基因，但通过我们的实验和分析数据库的已有数据，发现除ISApl1外，与mcr-1基因直接相连的nikA-nikB基因序列也占据着重要地位。5）从流行数据来看，ISApl1基因的缺失，并没有减弱mcr-1基因的传播和扩散。 nikA-nikB基因元件与ISApl1一样，可以并列分布于mcr-1基因的5’端，nikB基因可以前移，剔除插入序列ISApl1直接与mcr-1相连接。6）nikA-nikB-mcr-1基因元件在菌种中的分布也相当广泛，除常见于大肠埃希菌的质粒外，还分布于来源自病人或动物体的沙门氏菌和肺炎克雷伯菌的质粒上。本研究表明，移动元件，包括质粒，插入序列元件和转座子是细菌抗性进化中的双刃剑。本研究结果支持以下观点：抗生素过度使用可导致全球传播多重耐药细菌。因此，应该系统地对人类和动物的抗生素处方进行严格的调节，以减轻多重耐药细菌的威胁。通过本课题研究，发表SCI论文3篇，硕士研究生2名，指导3名本科生完成毕业论文。