AAV2-ND4治疗Leber’s 遗传性视神经病变转染效率及作用机制的研究

Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is among the most common causes of binocular blindness in adolescents. There are currently no effective therapies for LHON; however, but gene therapy for LHON has shown promising results. After eight years of research, we have resolved a series of technique problems in gene therapy for LHON. We treated nine LHON patients by intravitreal injection of AAV2-ND4, and six patients showed significant improvement in visual acuity. Over time, we realized that the safety and efficiency of AAV2-ND4 should be further improved. To this end, the present study focused on improving the structures of AAV2-ND4 and understanding their action mechanisms, with structural improvement primarily targeted towards the ND4 nucleotide sequences, promoters, and non-coding sequences. We developed AAV2-ND4 with 12 different structures and compared their transfection efficiencies and functions. We conducted in vitro experiments to investigate the transfection efficiencies of different AAV2-ND4 structures and capabilities of AAV2-ND4 to enter the cell mitochondria; we also conducted animal experiments to investigate the transfection efficiencies of AAV2-ND4 with different structures, expression efficiencies of exogenous ND4 in the retina, body’s immune responses, and action mechanisms underlying LHON treatment. We determined the safest and most efficient structure from among the investigated structures of AAV2-ND4, providing a foundation for future clinical translation.

Leber遗传性视神经病变（LHON）是导致青少年双目失明的最常见原因，目前没有有效方法治疗，基因治疗LHON是很有前途的方法。我们经过8年的研究，解决了一系列基因治疗LHON的技术难题，玻璃体腔注射AAV2-ND4治疗了9例LHON患者，有6例患者视力显著提高。随着研究的深入，我们认识到已有的AAV2-ND4需要进一步完善，本项目正是为了解决这一问题: 拟改进AAV2-ND4的结构，研究其作用机制，主要包括：ND4的核酸序列、启动子和非编码序列，根据这些改进构建12个不同的AAV2-ND4，对比研究它们的转染效率和功能：利用体外实验研究不同AAV2-ND4的转染效率，以及进入细胞线粒体的能力；利用动物实验检测不同AAV2-ND4的转染效率，外源性ND4在视网膜的表达效率，对机体的免疫反应，以及治疗LHON的作用机制。从中选择出最安全性最有效性的AAV2-ND4，为临床转化奠定基础。

在国家自然科学基金的资助下，我们研究了AAV2-ND4治疗Leber’s 遗传性视神经病变转染效率及作用机制，我们通过CAG，CMV，多种目的基因，以及不同的UTR序列构建多种重组腺相关病毒，通过玻璃体腔注射相关动物后，进行视网膜铺片，免疫荧光，视网膜切片，荧光定量PCR，ATP浓度的检测等等完成安全性和有效性的研究，进一步通过体外实验进行验证，使用构建后的病毒转染细胞。通过研究发现，主要是本实验设计的病毒，安全性可，RGC计数未出现异常，前节观察，眼压，流式，眼底照相均在正常范围内。通过qPCR，免疫荧光，视网膜铺片和切片，ATP浓度发现2号病毒，即CAG启动子，全长UTR和目的基因（NC-012920.1）时，有效性最佳。其次是1号载体，即CMV启动子，全长UTR和目的基因（NC-012920.1），有效性次之。为下一步的临床试验奠定基础。