祛瘀生肌法对糖尿病溃疡创面修复不同时相Ⅰ/Ⅲ胶原代谢MAPK信号调控的研究

基于"祛瘀生肌法"临床疗效，以及前期研究表明该法对相关生长因子、基质金属蛋白酶（MMP）的调控作用与胶原代谢的密切关系，提出："MAPK信号通路是祛瘀生肌法调控胶原代谢、促进创面愈合分子机制的关键"之假说。本项目以糖尿病溃疡创面为研究模型，动态研究在创面修复不同时相祛瘀生肌药物配伍规律，采用生物基因芯片筛选、实时荧光定量PCR法验证"祛瘀生肌法"对大鼠皮肤实验性创面新生肉芽组织MAPK信号通路相关差异基因，应用免疫组化法检测、western blot法验证MAPK通路中差异基因的蛋白表达及分布规律，酶联免疫法检测MAPK活性，分析这些相关基因和蛋白与MAPK活性、Ⅰ/Ⅲ型胶原变化的关系，阐释"祛瘀生肌法"调控胶原代谢、促进创面愈合与调节MAPK信号通路相关基因和蛋白的相关性，探索中医药治疗慢性皮肤溃疡疗效的分子生物学机制，从"微观辨证"角度寻找中医"宏观辨证"的科学证据。

①目的：观察祛瘀生肌中药对糖尿病大鼠溃疡创面变化影响，验证“MAPK信号通路是祛瘀生肌法调控胶原代谢、促进创面愈合分子机制关键”假说，探索中医药治疗慢性皮肤溃疡分子生物学机制。②方法：以糖尿病溃疡创面大鼠为研究平台，共观察90只大鼠，创面造模后分为成模7、11、15天3个时相，分层随机分为生肌化瘀1、2、3方组、糖尿病溃疡创面组和正常创面组，每组应用相应治疗方案。采用HE染色、透射电镜观察创面组织形态学差异，基因芯片检测MAPK信号通路在不同创面中表达差异，RT-PCR验证差异基因mRNA表达，免疫组化、Western blot检测相关基因蛋白表达及分布规律。③结果：糖尿病溃疡模型大鼠血糖水平自成模第一天开始显著上升，维持高血糖稳态，体重水平呈显著下降趋势；成模3、7、11、15d糖尿病溃疡创面组大鼠创面愈合率低于正常创面组，成模7d，生肌化瘀1、3方组创面愈合率明显高于糖尿病溃疡创面组，成模11、15d，生肌化瘀3方组创面愈合率均明显高于生肌化瘀1、2方组、糖尿病溃疡创面组。RT-PCR显示与糖尿病溃疡创面组比较，祛瘀生肌中药下调成模7、11、15天MKP、JNK、IL-1β mRNA表达，上调P53、IL-1R，上调成模7、11d，下调成模15天P38表达；Western blot、免疫组化显示：糖尿病溃疡创面组MKP-1蛋白表达水平比正常创面组低；祛瘀生肌中药各组MKP-1蛋白表达均下降；正常创面组MMP-2蛋白表达高于糖尿病溃疡创面组，生肌化瘀2方组MMP-3蛋白表达高于3方组，祛瘀生肌中药各组和正常创面组MMP-8蛋白表达均低于糖尿病溃疡创面组，生肌化瘀2方组MMP-13蛋白表达高于糖尿病溃疡创面组和正常创面组，TIMP-1与MMP-2、MMP-3蛋白表达呈现负相关。④结论：实验建立大鼠糖尿病溃疡模型稳定可靠；糖尿病减缓大鼠溃疡创面愈合，MAPK信号通路在糖尿病溃疡创面愈合中发挥重要作用，与高血糖水平调控JNK、MKP-1、P38、P53、IL-1β等调节因子有关；祛瘀生肌法促进创面愈合，祛瘀生肌中药调控MAKP通路促进糖尿病溃疡愈合，其作用机理与降低MKP-1蛋白表达，上调p38、p53，下调JNK、IL-1β等相关调节因子有关；祛瘀生肌法实现对创面修复过程中I、Ⅲ型胶原分解与合成的平衡水平调控，可能是通过调控MMPs及抑制剂TIMP-1的比例来实现的。