青蒿琥酯增强肝枯否细胞内化清除内毒素的作用及其机制研究

脓毒症是临床病人死亡的主要原因之一，寻找有效药物并阐明其作用机制具有重要意义。LPS是脓毒症主要致病因子，前期研究发现青蒿琥酯(AS)可通过降低血清LPS水平保护脓毒症小鼠，但体外实验发现AS不能直接结合、中和LPS，却能增加肝枯否细胞(KCs)对LPS的内化，机制不清。因此，本研究以KCs为对象，从两个层次研究AS内化清除LPS的机制：①AS增加LPS内化的途径：从RNA和蛋白水平观察AS对内化相关受体表达的影响；阻断相关内化途径后，观察AS处理前后LPS内化和细胞因子释放的改变，明确AS增强LPS内化的途径；②AS对LPS代谢酶AOAH的影响：通过检测AS对AOAH mRNA和蛋白表达、酶活性的影响及AS与AOAH蛋白的亲和力，明确AS是通过上调AOAH表达而增加酶生成（量），还是直接与酶结合而激活酶活性（质）。旨在探讨AS增加LPS内化清除机制，为发现治疗脓毒症的新靶点奠定基础。

本课题基于青蒿琥酯(AS)降低血清LPS水平保护脓毒症小鼠作用与增加肝枯否细胞(KCs)对LPS的内化有关，以KCs为对象，从两个层次对AS内化清除LPS的机制进行了研究。课题按项目计划书要求基本完成全部研究内容，并对研究过程中的新发现进行了扩展性研究。研究结果如下：①AS不但可以促进肝KCs对LPS的内化，还可以促进腹腔巨噬细胞对LPS的内化，但明显抑制LPS引起的两种细胞释放炎性细胞因子TNF-α和IL-6，提示AS引起的LPS内化促进作用主要与清除LPS密切相关，并不促进炎症反应；②AS并不是通过抑制网格蛋白或内体酸化，而是通过上调清道夫受体表达促进LPS内化；③AS可抑制LPS诱导的小鼠肝KCs细胞和腹腔巨噬细胞LPS代谢酶AOAH mRNA的表达，但AS不能与AOAH小亚基发生直接结合，且对AOAH活性没有影响，提示AS并非通过上调AOAH表达或活性来促进LPS内化清除的。计划书之外的研究结果：①AS处理及LPS刺激均可促进自噬体的形成，但AS并不能进一步促进LPS所引起的自噬增加，抑制自噬体的形成并不影响炎性细胞因子的释放水平，说明AS不非通过细胞自噬过程增加小鼠腹腔巨噬细胞对内毒素的内化清除；②AS可增加小鼠腹腔巨噬细胞对FITC标记大肠埃希菌的内化和清除，该作用与上调小鼠巨噬细胞的抗菌性自噬有关；③在该基金经费资助下进行了菊科蒿属植物白叶蒿化学成分的分离和初步活性评价。