利用混合细胞外基质扩增hESC及其机制研究

The feeder-free culture system of human embryonic stem cell (hESC) is composed of culture medium and extracellular matrix (ECM). At present, the internationally used extracellular matrices are derived from animal cells. Components of animal origin and unknown substances are not helpful for researchers to study the molecular mechanism of hESC and the clinical application of hESC in the future. In the previous study, the applicant initiatively found that mixed ECM derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) and human foreskin fibroblasts (HFF) by freeze-thaw method could support the application of hESC. Based on the finding, the project will screen the crucial ingredients of mixed ECM that suppot the feeder-free growth of hESC, investigate the potential mechanism, and develop the new defined feeder-free culture system of hESC. The study will reveal the mechanism of extracellular matrix in maintaining self-renewal ability of hESC. The defined feeder-free culture system of hESC developed in this project is helpful to investigate biochemical characteristics and molecular mechanism of the proliferation and differentiation of hESC in vitro and create conditions for the clinical application of hESC in the future.

人胚胎干细胞（hESC）无饲养层培养体系由培养基和细胞基质两部分组成。目前国际通用的细胞基质为动物源性物质，当中所含的动物源成分和不明物质不利于研究者对hESC分子机制的研究以及未来hESC的临床应用。项目申请人在前期工作中首创性地发现小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和人包皮成纤维细胞（HFF）混合铺皿后通过冻融法制成的胞外基质能很好地支持hESC生长，本项目将在此基础上筛选出这种基质中发挥作用的蛋白成分，研究其支持hESC生长的分子机制，并以此蛋白为胞外基质建立新的、成分明确的无饲养层培养体系。这项工作将揭示细胞外基质对hESC体外培养中自我更新能力维持的作用机制，本项目探索建立的成分明确的培养体系有利于研究hESC体外增殖和分化的生化特征及分子生物学机制，并且为将来hESC进入临床应用创造条件。

人胚胎干细胞（human embryonic stem，hES）在细胞治疗和器官替代治疗等方面有着广泛的应用前景。传统方案中，hESC是被培养在胎鼠成纤维细胞或人源饲养层细胞上，但生长在无饲养层培养体系中的hESC更容易被分离，能为下游应用提供更纯的干细胞，因此无饲养层体系的开发是目前的研究热点。无饲养层培养体系由培养基和细胞基质两部分组成。目前，无饲养层培养体系效果不理想的原因可能在于我们还未找到合适地支持hESC生长的细胞外基质蛋白（extracellular matrix, ECM），寻找新的细胞外基质蛋白是亟待解决的问题，具有重大的研究意义。在本项目中，我们利用冷冻复苏方法获得混合ECM，建立了一种新的无饲养层培养体系。hESCs能够在混合ECM体系中进行长期扩增培养（>15代），能够高水平表达碱性磷酸酶、干细胞特异性蛋白OCT-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-81、Nanog及全能性基因OCT-4，REX-1及Nanog，能够保持体内体外均具有向三胚层分化的能力。此外，我们发现混合ECM能够很好地支持不同的hESC细胞系（H1、HN4）和iPS细胞系的扩增，有着与Matrix gel相似的无饲养层培养效果，并且具有成本低、省时省力、操作简便的优势。为了寻找混合ECM中起关键作用的基质蛋白，我们先后对MEF-ECM、HFF-ECM及混合ECM三种饲养层细胞分泌的基质蛋白以及hESC细胞系（H1及HN4）和iPS细胞系自分泌的基质蛋白进行质谱检测。经过生物信息学分析后，我们筛选出了三个候选蛋白FN1、ILK和ITGB1，其中FN1蛋白已有报道认为其在hESC扩增中发挥重要作用，但ILK和ITGB1蛋白目前尚没有研究报道，我们将继续对其进行探索，明确背后的机制。