Pseudomonas sp. strain JS3051分解代谢2,3-二氯硝基苯的机理研究

Microorganisms play an important role in the degradation of organic pollutants. Chemical 2,3-Dichloronitrobenzene (2,3-DCNB) is a toxic pollutant widely used in chemical industries such as pesticide manufacturing. So far, no microbes capable of degrading 2,3-DCNB have been reported, let alone the analysis of its catabolic pathway. As seen in previous work, a strain of Pseudomonas sp. JS3051 capable of growing on 2,3-DCNB as the sole carbon source and nitrogen source was isolated from contaminated soil. Strain JS3051 is able to metabolize 2,3-DCNB by an oxidative pathway and release nitrite ions. This project aims to find the catabolic genes (cluster) involved in 2,3-DCNB degradation by genome/transcriptome sequencing and construction of insertion mutant library. The function of key genes and enzymes involoved will then be investigated, by using methods such as gene knockout and compensation, protein expression in vitro and enzymatic characterization, together with mass spectrometry. Finally, the catabolic pathway of 2,3-DCNB by strain JS3051 will be elucidated. The outcome of this study will reveal the unknown 2,3-DCNB catabolic pathway as well as help to explore the evolutionary relationship of catabolic pathways between polychlorinated nitroaromatic compounds and monochloronitroaromatic compounds. This project will also contribute towards a potential resolution for bioremediation application in 2,3-DCNB-contaminated environments.

微生物在降解有机污染物过程中具有重要作用。2,3-二氯硝基苯广泛应用于农药制造等化工产业，是一种有毒的污染物，但目前尚无微生物降解此污染物的报道，更无其代谢途径的解析。本申请的前期工作从污染环境中筛选到一株能以2,3-二氯硝基苯为唯一碳源、氮源生长的细菌Pseudomonas sp. JS3051。该菌株通过氧化途径代谢2,3-二氯硝基苯并释放亚硝酸根离子。本项目拟通过基因组／转录组测序及构建插入突变文库等方法寻找JS3051菌株2,3-二氯硝基苯的代谢基因（簇）。借助基因敲除及互补、蛋白的体外表达及酶学特性研究等方法，结合质谱分析对基因及其编码产物功能进行鉴定，最终阐明2,3-二氯硝基苯的代谢途径及其分子机理。本研究结果将会解析尚未知晓的2,3-DCNB代谢途径，揭示多氯硝基芳烃与单氯硝基芳烃微生物代谢途径的进化关系，并在2,3-二氯硝基苯环境污染的微生物修复方面将具有潜在的应用价值。

微生物是自然界重要的分解者，几乎能降解自然环境中所有的天然有机物，而且很多人工合成的有机物也能被微生物降解，微生物是处理难降解有机污染物的最佳选手。硝基芳烃类化合物是苯环上至少含有一个硝基取代基的芳烃化合物，其来源包括天然来源以及人工合成。人工合成的硝基芳烃化合物种类繁多，被广泛的用于化工、染料、炸药等生产，由于他们在环境中非常稳定，被认为是持久性有机污染物。因此，本研究将解析2,3-二氯硝基苯（2,3-DCNB）的尚未知晓的微生物代谢途径、关键酶的催化机制及其进化渊源。本研究在前期获得了一株能以多氯硝基芳烃2,3-二氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长的菌株Diaphorobacter sp. strain JS3051，该菌株可能通过氧化途径代谢2,3-二氯硝基苯。在此基础之上，本研究解析了JS3051菌株中2,3-二氯硝基苯的分解代谢途径，发现2,3-二氯硝基苯双加氧酶DcbAaAbAcAd催化2,3-二氯硝基苯的起始双加氧反应，生成3,4-二氯邻苯二酚。点突变及活性分析表明2,3-二氯硝基苯双加氧酶的催化亚基Ac的E204残基对该酶的底物选择性至关重要。此外，探讨了2,3-二氯硝基苯与单氯硝基芳烃、萘、硝基苯等芳烃化合物代谢途径的进化渊源。遗传、生化和结构生物学证据都证明2,3-二氯硝基苯双加氧酶与2-硝基甲苯双加氧酶的亲缘关系最近。而dcc基因簇编码了代谢3,4-二氯邻苯二酚相关的酶，DccA催化3,4-二氯邻苯二酚的开环反应，酶促反应动力学研究显示DccA对3,4-二氯邻苯二酚具有很高的亲和力和催化效率。本研究结果拓宽了人们对氯代硝基芳烃代谢途径多样性的认识，为了解微生物如何通过适应性进化获得氯代硝基芳烃化合物的降解能力提供新的见解，并在2,3-二氯硝基苯环境污染的生物修复方面具有潜在的应用价值。