可控四链体折叠引导的DNA纳米组装及可开关分子传感与成像应用

The core structures of conventional G-quadruplex and i-motif are both composed of identical bases, and thus it is difficult to control the intermolecular folding of different G-rich or C-rich strands. For this reason, there are some unwanted by-products in DNA nanoassemblies directed by conventional bimolecular G-quadruplex or i-motif. To resolve this problem, we introduce some noncanonical base tetrads and pairs into the core structures of G-quadruplex and i-motif to design unsymmetrical bimolecular structures with the improved stability. As a consequence, the dimerization of component strands is avoided, namely, the controllable folding of G-quadruplex and i-motif is achieved. The resulting quadruplex structures are verified by circular dichroism and nuclear magnetic resonance. Then, we utilize the designed bimolecular G-quadruplex and i-motif to functionalize a DNA tetrahedron scaffold, and monitor its switchable assembly by gel electrophoresis, fluorescence resonance energy transfer, and atomic force microscopy. Integrating a RNA-cleaving DNAzyme into this tetrahedron scaffold, a molecular gear-like DNA machine is devised. With this basis, we further employ the quadruplex-directed DNA nanoassembly system to analyze the disease-related nucleic acid biomarkers, and then imaging these target molecules in living cells by fluorescence microscopy. This project provides a new strategy to resolve difficulties in DNA nanoassembies on the molecular scale. Taking advantage of the changes of intracellular K+ and pH, it will find extensive applications to demonstrating some life rules in the cell metabolism and canceration processes.

传统G-四链体和i-motif核心结构均由相同碱基组成，其分子间折叠难以控制，用于DNA纳米组装时，会产生不必要的副产物。针对这一问题，我们在其核心结构中引入一些非经典的四元、二元碱基组来设计具有较高稳定性的非对称性双分子结构，避免组份链二聚，实现G-四链体和i-motif可控折叠，该设计结构以圆二色谱、核磁共振进行表征。然后，我们以设计的G-四链体和i-motif双分子结构来功能化DNA四面体脚手架，利用凝胶电泳、荧光共振能量转移、原子力显微镜等监测DNA四面体组装的开关调控，并结合DNA裂解酶构建类似分子齿轮的DNA机器。在此基础上，我们将四链体调控的DNA纳米组装体系用于疾病相关核酸标志物的传感分析，并对细胞活体内目标物进行荧光显微成像。本项目提供了一种从分子层面来探索解决纳米组装宏观问题的新思路，利用细胞体内K+、pH变化，有望在揭示细胞代谢、癌变过程等生命规律方面进行扩展应用。

G-四链体（G4）、i-motif由于其结构稳定且可逆、易于调节控制等特点，目前在程序化DNA纳米组装与分子机器操纵方面已得到广泛应用；然而传统 G4和i-motif的核心结构均由相同碱基组成，其分子间折叠难以控制，用于DNA纳米组装时，会产生不必要的副产物。鉴于此，本项目主要围绕折叠可控的双分子G4、i-motif结构的设计开发，以及它们在DNA纳米脚手架的有序组装与可开关的传感分析等应用方面开展相关研究工作，并取得了重要研究成果。.首先，我们在双分子G4结构中引入迷你发夹环、三链等亚结构单元，在促进G4结构稳定性的同时，还提高了其同源、异源折叠构型的可控性，很好地解决了双分子G4易于发生超分子聚集的科学问题。另外，我们在双分子i-motif结构中引入平行双链等亚结构单元，不仅可程序化控制其同源、异源折叠构型，还为硫黄素等苯并噻唑类荧光配体提供普适性结合位点，解决了传统 i-motif与配体作用效果普遍较差这一难题。在上述研究基础上，我们以G4、i-motif作为控制单元，探讨了它们调控DNA纳米脚手架可逆组装的能力，并与ATP适配体、过氧化物酶活性的DNAzyme等功能核酸结合，利用它们对细胞内源物质如K+、H+、ATP等环境因子的特异性响应，以DNA纳米结、三角形、四面体、三棱柱、立方体等作为纳米脚手架，构建了一系列能够反复操作的DNA纳米器件，其中包括逻辑识别细胞溶酶体、癌细胞膜等酸性细胞微环境的DNA级联回路，细胞膜表面受激响应的动态变构的DNA纳米机器，携带小分子核酸药物的高效靶向跨膜递送体系，模拟人类端粒酶二聚激活的DNAzyme纳米开关（代替了原方案中效果不佳的依赖DNA裂解酶的分子齿轮型DNA机器）。进一步地，我们基于双分子G4、i-motif带来的邻近诱导效应，发展了多种开关可控的适配体传感器与DNA纳米分析平台，并成功应用在胞内mRNA等疾病标志物荧光成像与表达调控，以及细胞信号分子外泌过程动态监测等方面。.总之，本项目充分揭示了G4、i-motif结构在DNA纳米组装以及分子传感与细胞成像等方面的重要科学研究意义，极大拓展了它们在生物分析等相关领域的应用前景。