祛瘀生肌法促进糖尿病溃疡上皮化功能的相关机制研究

基于"祛瘀生肌法"的临床疗效，以及前期研究表明该法对相关生长因子、成纤维细胞与胶原代谢的密切关系，结合国内外Wnt信号通路与创面愈合的研究进展。提出："祛瘀生肌法参与调控Wnt/β-catenin 信号通路可能是促进糖尿病溃疡上皮化愈合的关键机制之一"之假说。申请者前期研究发现经典Wnt信号通路β-catenin蛋白表达与难愈性溃疡相关。在此基础上，本项目拟以逆转录病毒干预大鼠糖尿病溃疡为研究模型，综合运用基因芯片、免疫荧光、Real-time PCR与Western blot技术，通过探求祛瘀生肌法调控糖尿病溃疡愈合上皮化形成过程中，经典Wnt信号通路相关基因Wnt-3a、β-catenin、GSK3β、Fzl及下游靶基因c-myc、K6等指标的时序变化，阐明祛瘀生肌法在糖尿病溃疡上皮化阶段运用的物质基础。

本项目基于“祛瘀生肌法”的临床疗效，以及前期研究表明该法对相关生长因子、成纤维细胞与胶原代谢的密切关系，结合国内外Wnt信号通路与创面愈合研究进展基础上，主要致力于进一步完善祛瘀生肌法的愈创机制。按照项目申请内容，主要完成以下研究工作：1）以龙血竭素为内参，建立了稳定的祛瘀生肌膏药物控制标准，其中龙血竭素的相对保留时间为t=37.65min，可作为不同批次生肌化瘀膏稳定的质量考核指标；2)运用STZ造成的糖尿病小鼠为研究平台，体外证实了祛瘀生肌中药有效促进糖尿病溃疡创面愈合(其中生肌化瘀膏优于生肌膏，化瘀膏)。生肌化瘀膏在不同时间段的溃疡面积均小于基质对照组，以造模后Day11天差异最为显著（69.9±10.5% vs 48.6±19.2%, P<0.05）。具体表现在创伤愈合早期减少急性炎症细胞募集，活化巨噬细胞，中期促进表真皮细胞增殖，上皮舌迁移增加，后期降低血管增生。同时，重塑期反映胶原合成的Masson染色阳性面积显著高于对照组（33.3±6.7 vs 10.7±2.1%，P<0.00）。3）通过体外Wnt3a（DKK1）质粒转染，分别从离体和在体实验证实了Wnt信号通路活化（抑制）对糖尿病溃疡愈合过程的影响。4）运用基因芯片技术，分析得到糖尿病溃疡小鼠与正常小鼠的差异基因表达差异(包括TGFbeta、Wnt)，明确祛瘀生肌中药主要调节Wnt信号通路相关基因如Wnt7a、Wnt3a，β-Catenin、Wif1、DAAM1、DVL3、NKD1、NFAT5、Sfrp1、PPP2R5E、PPPP2R5A等指标表达。进一步以免疫荧光、Real-time PCR与Western blot技术深入验证差异表达Wnt相关基因，阐明了祛瘀生肌法在糖尿病溃疡上皮化阶段运用过程中干预Wnt信号通路的物质基础。证实“祛瘀生肌法参与调控Wnt/β-catenin信号通路是促进糖尿病溃疡上皮化愈合的关键机制之一的科学假说。