基于人工miRNA调控的衣藻产氢研究

绿藻氢酶的活性是光合细菌和蓝藻中氢酶活性的100多倍, 因此绿藻光合放氢是国际上公认最具有应用前景的生物制氢途径。然而，绿藻氢酶受藻细胞内光系统II的光合放氧抑制, 使得其持续放氢时间只有几秒到几分钟。通过申请者所在课题组的前期研究发现，一种在维持光系统II 的稳定性和保证衣藻正常光合作用的蛋白-OEE2，与光系统II的光合放氧活性密切相关。本项目拟以单细胞真核绿藻-莱茵衣藻作为实验材料，利用人工miRNA干扰技术，针对影响衣藻光系统II活性的基因OEE2进行调控，并研究OEE2基因沉默后对衣藻细胞光系统II活性的影响，以期解除衣藻光合放氧对氢酶的抑制作用，最终通过基因调控的手段达到衣藻持续产氢的目的，并探索最有利于衣藻光合产氢调控组合的技术，为进一步探讨绿藻生物光合产氢的分子调控机制提供重要的理论依据。

利用绿藻光合产氢被认为是目前最具有应用前景的生物制氢途径。然而，绿藻产氢由于受到光合放氧反应的抑制，如何对绿藻光合产氢的持续性调控成为制约本领域发展的瓶颈问题。本项目首创性地提出利用人工miRNA（amiRNA）对莱茵衣藻光合放氧相关的靶基因进行可诱导调控，使衣藻细胞的产氢效率得到显著性提高，具体结果如下：.（1）.基于“两步法”对莱茵衣藻“正常培养-缺硫培养”交替处理后，衣藻光合产氢时间显著增加的新发现（Melis et al. 2000），本项目对正常培养与缺硫培养的莱茵衣藻细胞的总蛋白进行组学分析。二维双向电泳与质谱学结果显示，23个蛋白点发生显著性变化，其中氧气释放增强蛋白2（OEE2）由于与衣藻光合放氧和光系统II活性密切相关，被筛选为后续项目研究的靶基因；.（2）.利用实时荧光定量PCR技术，进一步研究OEE2基因在缺硫培养条件下的表达。结果显示，缺硫培养后OEE2在转录水平的表达下降为对照组的16.6%；.（3）.基于WMD3 在线平台针对OEE2设计人工miRNA，并利用高丰度的衣藻内源性cre-MIR1162作为人工miRNA的表达框架，成功构建莱茵衣藻的热激调控表达载体；.（4）.利用“珠磨法”对野生型衣藻细胞进行衣藻转化，并成功筛选鉴定阳性单克隆转基因藻株。经过热激处理，人工miRNA表达量明显被诱导（上调29倍），靶基因OEE2表达量受到明显的抑制作用（下降60%）；.（5）.通过气相色谱法，利用氩气作为载气，对人工miRNA调控的转基因衣藻与野生型衣藻的产氢效率与耗氧能力进行了对比。在热激诱导处理后，转基因衣藻株单位产氢量为对照组的三倍以上，与此同时，转基因衣藻的耗氧能力在人工miRNA调控下显著提高；.（6）.利用WATER PAM对转基因衣藻和野生型衣藻的光合活性进行分析，通过热激诱导人工miRNA的表达，转基因衣藻的光合活性受到显著抑制，关键指标如 Fv/Fm、Yield、ETR、qP分别下降30%、77%、79%、64%。转基因衣藻的生理生化差异仍需进一步深入研究。.本研究结果为解决绿藻光合制氢所面临的科学瓶颈问题—绿藻连续放氢分子机制和调控技术提供了新的途径，为氢能制备、氢能发电和氢燃料电池等产业提供重要的基础理论和应用技术。