衣藻乙酸代谢突变体ACM1基因克隆及其在光合产氢中的作用

氢气是最好的清洁能源。藻类光合产氢是微藻利用太阳能分解水产氢的过程，是可再生、绿色清洁的最理想生物制氢方式。目前由于缺乏高效产氢的遗传改良藻株和规模化培养成本偏高，严重影响了该制氢途径的工业化应用。先前的研究结果表明，培养基中乙酸的存在显著影响绿藻产氢的效率，但乙酸是否为产氢过程所必需以及如何影响的分子作用机制尚不清楚。 因此，本项目以光合产氢的模式藻种- - 莱茵衣藻为材料，从已经筛选得到的乙酸代谢突变体ACM1入手进行深入探讨。 通过已优化的衣藻基因克隆方法，获得突变基因的完整序列。采用细胞生物学、生物化学和分子遗传学等研究手段, 在细胞、亚细胞、基因和蛋白水平阐明该基因及其编码蛋白的生物学功能。研究结果不仅能够发现衣藻乙酸同化中可能存在的新的作用元件，也有助于揭示乙酸与产氢代谢网络中的节点和作用方式，对发现衣藻高效率低成本制氢的新思路和新方法，具有重要意义。

氢气是最好的清洁燃料。绿藻光合产氢是在叶绿体基质中进行的、由氢酶催化将质子还原为氢气的反应，是最理想绿色清洁可再生的生物制氢途径。目前限制工业化应用的主要问题是缺乏高效产氢的遗传改良藻株及规模化培养成本偏高。以往的研究发现，培养基中乙酸的存在能够显著提高绿藻光合产氢的效率，但乙酸同化的分子机制及其与产氢代谢的关系尚不清楚。本项目针对这一重要科学问题，以光合产氢的模式藻种莱茵衣藻为材料，利用其基因组序列信息和研究体系，对野生型和乙酸代谢突变体ACM1的乙酸同化及其产氢效率进行比较，并对它们的蛋白质代谢网络特征进行了深入分析。首先，通过叶绿素荧光与产氢相关参数相结合的方法，从前期构建的衣藻突变体库中采用质粒随机插入的方法，筛选获得了包括ACM1在内的一批光合产氢突变体。其次，对野生型和ACM1突变体的乙酸同化及其产氢表型效率进行比较分析，获得了ACM1突变体在TAP培养基中培养60小时同化的乙酸量仅为野生型一半（53%）、产氢延迟（120小时后）且最大产氢量不到野生型的1/3的定量信息，明确了ACM1乙酸代谢异常与其产氢能力下降的相关关系。通过尝试一系列不同的引物及片段扩增条件，建立了高效准确地分离衣藻基因的方法，获得了突变基因acm1等的完整序列。对野生型与ACM1突变体中已知的乙酸循环关键基因进行了qPCR检测分析，获得了acm1缺失影响乙酸代谢的转录水平调控信息，明确了突变体乙酸同化效率降低的分子基础。优化了蛋白质提取及样品制备及电泳分离方法，获得了野生型和ACM1突变体可溶性蛋白分辨率高重复性好的双向电泳图谱进行了定量分析，发现了两倍及以上差异蛋白点178个。进一步采用同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ）对野生型和ACM1突变体可溶性蛋白进行定量蛋白质组学研究，发现了上千个差异表达蛋白，其中变化1.5倍及以上蛋白近400个。生物学功能聚类分析结果发现，差异表达蛋白涉及了细胞代谢的各个方面，其中近40%糖代谢及能量代谢有关，30%为光合作用相关蛋白，有10%以上参与蛋白质周转及质量控制蛋白。其它差异表达蛋白与细胞壁与鞭毛代谢、抗氧化作用以及信号转导相关。此外还发现了10%的未知功能蛋白，本研究首次证实了它们在衣藻细胞中表达，并参与/影响乙酸同化/光合放氢过程。研究结果不仅揭示了新基因acm1的生物学功能，也为阐明绿藻光合产氢的分子调控机理奠定了重要基础。