利用量子点探针单分子荧光跟踪技术研究整合素内吞循环在肿瘤细胞迁移中的作用机制

Integrins, the key component proteins of focal adhesions, can regulate the assembly and disassembly of focal adhesions through the endocytosis and recycling (EAR), which plays an important role in tumor cell migration. The mechanism underling actions of tumor cell migration through integrin EAR is unclear, due to the complexity of integrin EAR and the limitation of previous biological approaches. The single-molecule fluorescence tracking method emerged recently prove to be effective in studying the movement of protein molecules. To apply this method to integrin, we will establish single-molecule fluorescence tracking platform for integrin research，by improving the techniques in three areas: quantum dot labeling, multicolor high-speed synchronous imaging and trajectory identification and segmentation method. In this project, based on our previous study of the endocytic trafficking of EGFR, we will track α5β1 integrin during the whole EAR process by single-molecule fluorescence imaging, and study the mode, pathway and dynamics of the integrin EAR, in order to reveal the mechanism of integrin EAR promoting tumor cell migration. Furthermore, we will explore the mechanism of integrin EAR affecting tumor cell migration by comparing tumor cells in different migration speed. This project is of great importance not only to elucidate mechanism of action on tumor cell migration by integrin EAR, but also to understand the process of tumor metastasis and to provide clues for chemotherapeutic drug design.

整合素是构成细胞粘着斑的关键蛋白，通过内吞循环调控粘着斑的组装和解离，在肿瘤细胞迁移中发挥重要作用。由于其内吞循环过程的复杂性和以往生物研究方法的局限性，目前为止整合素内吞循环在肿瘤细胞迁移中的具体作用机理仍未阐明。单分子荧光跟踪方法是近年来被证实为研究蛋白分子运动的有效方法，为将此方法应用于整合素研究，我们拟在量子点标记、多荧光成像和轨迹数据分析三方面加以完善，建立单分子荧光跟踪整合素实验平台。我们将在研究表皮生长因子受体（EGFR）内吞运输的基础上，单分子荧光跟踪整合素α5β1在肿瘤细胞迁移中的完整内吞循环过程，研究其内吞循环的模式、路径和动力学，以揭示其促进肿瘤细胞迁移的作用机理，并且通过比较不同迁移速度的肿瘤细胞进一步研究整合素α5β1内吞循环影响肿瘤细胞迁移的机制。本项目在揭示整合素内吞循环在肿瘤细胞迁移中的作用机制，及在探索癌症转移机理和帮助抗癌药物研发等方面有重要意义。

生物大分子动力学是细胞内一切生命活动的重要基础，在细胞的代谢、信号传导、分化以及物质运输等方面中起到关键作用。整合素作为一种位于细胞黏着斑上的跨膜蛋白，以内吞转运方式参与调控细胞的迁移。为了研究整合素蛋白这类生物大分子在细胞内的转运动力学特点，本项目搭建了一个活细胞内单分子荧光跟踪整合素的实验平台，并在此平台上研究了整合素的转运动力学特征，特别针对其扩散行为进行了深入分析，此外也研究了其他模式细胞中的生物大分子动力学。所取得的重要结果包括：（1）建立了一套完整的活细胞内单分子荧光跟踪整合素蛋白的实验平台，其包括整合素蛋白的量子点探针标记、活细胞内的多色荧光高速成像、以及轨迹识别分类算法三部分具体内容。（2）研究了整合素内吞转运的动力学特点，分别对其在细胞内的被动扩散和主动运输进行了定量化分析，获取了相关动力学参数，并发现整合素在细胞内的运动模式以扩散为主。（3）针对整合素等生物大分子在细胞内的扩散特征，提出了一种基于单量子点跟踪技术快速测量细胞内扩散分布的新方法；首次发现细胞内生物大分子的扩散分布呈区域化的特点，而且证明了该现象主要源于内质网的空间限制。（4）拓展相关研究，阐明了酵母细胞中丝状蛋白结构体的动力学特征。本项目不仅在实验仪器上为将来的细胞内生物大分子动力学研究打下了基础，而且在实验方法上建立了成熟的技术方案，如整合素荧光标记技术，细胞内生物大分子扩散分布测量技术。本项目中首次发现的细胞内生物大分子扩散分布的区域性特征，以及酵母细胞中的丝状蛋白结构体的受限扩散特点，有助于进一步理解细胞内的生物大分子动力学及其功能。本项目共发表文章3篇，其中包括一篇Journal of the American Chemical Society，一篇Journal of Genetics and Genomics封面文章，培养博士生3名。