核酸G-四链体结构对伪狂犬病毒EP0基因表达的影响

Aujeszky's disease is an acute infection caused by pseudorabies virus (PRV), this pathogen bring about huge economic losses in swine industry. By now many papers have reported that EP0, an early protein of PRV, regulates other gene expression of PRV, however, there is little known about the mechanism underlying EP0 gene expression. Now it has been extensively accepted that G-quadruplexes formed in DNA or RNA can regulate gene expression, and there has been considerable evidence demonstrate that quadruplexes exits in the genome of mammalian cells and virus. According to bioinformatic searches we first found the upstream region of EP0 promoter have G-rich sequence, and our initial results indicated that region in vitro can form G-quadruplex as expected. So, we propose a hypothesis here: EP0 expression is regulated by the quadruplex formed in upstream flanking region of EP0 gene. In this project, first, our aim to identify the quadruplex formed in the promoter of EP0 gene, second, to examine the effect of quadruplex on activity of promoter; third, to determine the effect of G-quadruplex on the EP0 expression and PRV reproduction. In conclusion, G-quadruplexes throw light on investigating the mechanism regulating gene expression of EP0, and provide clues to explore new therapeutic targets towards PRV.

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(PRV)引起的急性传染病，该病给养猪业造成了巨大的经济损失。EP0作为PRV的一个早期蛋白调控病毒其它基因表达，对此已经有许多文献报道，然而关于EP0基因的表达调控机制还知之甚少。目前研究表明富含鸟嘌呤碱基的DNA或者RNA形成G-四链体结构对基因表达具有调节作用，而且证实该结构存在于真核细胞和病毒的基因组上。我们通过软件分析，首次发现EP0基因的启动子区域存在富含鸟嘌呤碱基的序列，并且初步实验证实该序列形成G-四链体结构，据此我们提出如下假说：EP0基因通过启动子区域形成的G-四链体结构调控其表达。因此本项目就是验证上述假说，我们首先验证EP0启动子区域形成G-四链体结构，评价该结构对启动子活性的影响，进一步确定G-四链体结构对EP0基因表达和病毒增殖的影响，最终从核酸结构的角度阐述调控EP0基因表达的分子机制，也为研究新型的抗PRV靶点提供线索。

富含鸟嘌呤碱基（G）的DNA和RNA能够形成由G-四聚体平面叠加而成的G-四链体二级结构（G4），越来越多的研究报道G4核酸普遍存在于病毒，原核生物和真核生物的基因组上，参与重要的生命活动过程，例如DNA重组，复制，RNA转录和翻译。PRV作为猪伪狂犬病的主要病原微生物，导致仔猪死亡，母猪流产，成年猪发生呼吸系统疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失。为了有效防控PRV的流行和暴发，有必要对病毒基因的表达调控进行深入系统的研究。EP0作为PRV的前期基因，其表达产物影响其它基因表达，对PRV的生活周期起着重要的调控作用，但是调控EP0基因表达的分子机制还不清楚。本项目通过生物信息学分析发现EP0基因启动子区域存在富含G序列，该序列包含三个SP1结合位点。圆二色谱分析，凝胶电泳试验证实该序列在K+溶液中形成G4平行结构，FRET melting试验和电泳试验显示小分子化合物PDS特异性结合稳定G4结构；DMS足迹保护试验和Taq酶延伸阻滞试验进一步证实G4形成，并且鉴定参与形成G4的G碱基。EMSA试验证实SP1蛋白倾向结合G4核酸。荧光素酶报告基因试验表明在PDS作用下，G4结构对EP0启动子活性具有负调节作用。进一步的病毒学试验发现PDS显著抑制PRV在Vero细胞内的复制。该项目的研究结果不仅对PRV的DNA结构和基因表达调控提供了新的认识，而且为防控PRV提供了潜在的分子靶标。