基于mTOR和Mnk1双靶点策略的苦参等5种中药抑制翻译起始活性成分研究

Compared with normal cells, tumor cells exhibit high levels of global translation initiation, especially prefer to translate cell proliferation, anti-apoptosis, angiogenesis and invasion related proteins. eIF4E is the key enzyme controlling protein translation initiation. eIF4E-related pathway inhibitor has become a research hotspot in the investigation of translation initiation inhibitor.However, single target inhibitor (such as mTOR, Mnk1) has poor efficacy and is highly vulnerable to induce resistance. Interestingly, the combination of eIF4E-related pathway inhibitors targeting different kinase plays a synergistic effect. Based on this finding, the aim of this project is to establish a double-target screening system of eIF4E-related pathway inhibitors. We want to select small molecule compounds containing mTOR and Mnk1 dual inhibitory activity from the TEM small molecule library and detect its anti-osteosarcoma effect and the influence on eIF4E-mediated translation initiation.This work will make contribution to explore targeted antitumor drugs from TCM and provide scientific basis for the advancement and future development of TCM.

肿瘤细胞与正常细胞相比，翻译起始水平全局性上调，特别是一些细胞增殖、抗凋亡、血管生成、侵袭等相关蛋白的翻译起始效率上调得尤为显著。eIF4E是蛋白质翻译起始关键限速酶，eIF4E相关通路抑制剂也成为翻译起始抑制剂中的研究热点。但是，现有的eIF4E相关通路抑制剂主要是针对单一靶点（如mTOR、Mnk1），效果较差并极易诱导耐药。而针对不同靶点的eIF4E相关通路抑制剂联合使用可以起到协同增效作用。基于这一发现，本项目拟从双靶点角度建立新的eIF4E相关通路抑制剂筛选系统，并利用中药小分子化合物库，筛选出具有mTOR和Mnk1双重抑制活性的小分子化合物；并通过检测目标化合物对骨肉瘤细胞体内外增殖转移以及对于eIF4E介导翻译起始的作用，明确其抗肿瘤药效及机制。本项目开展将为从中药中挖掘靶向性抗肿瘤药物打下扎实的工作基础，也是为中药资源的合理开发提供重要依据。

翻译起始效率显著上调是肿瘤细胞的一个显著特征，抑制蛋白质翻译起始关键限速酶eIF4E相关通路可以发挥抗肿瘤功效。而双靶点抑制剂（mTOR和Mnk1双重抑制剂）可以解决eIF4E相关通路抑制剂的开发上的难题，从而开发出更有效的翻译起始抑制剂。本研究主要完成以下工作：（1）基于mTOR和Mnk1双靶点筛选策略，发现6个具有抗肿瘤活性的中药活性成分（Walsuronoid B、Eucalrobusone C、Physakengose G、Icariside II、Physagulide Q、Glycyrrhetinic Acid），其中从扶正固本类中药淫羊藿中发现能同时抑制mTOR和Mnk1活性的中药活性成分Icariside II。（2）本研究发现Icariside II对体内外骨肉瘤细胞增殖具有抑制作用。本研究利用MTT方法检测了Icariside II对骨肉瘤U2OS、SW1353和S180细胞增殖的作用。结果表明Icariside II可以在体外抑制骨肉瘤细胞的增殖。Edu实验证明Icariside II能够抑制骨肉瘤U2OS、SW1353和S180细胞的DNA合成，抑制增殖。半乳糖试验证明Icariside II通过抑制糖酵解从而抑制骨肉瘤增殖。其后本研究用荷S-180移植瘤小鼠模型评价Icariside II对体内骨肉瘤细胞增殖的作用。结果显示，Icariside II处理组平均瘤重明显小于荷瘤对照组，表明Icariside II能显著性抑制S-180荷瘤小鼠体内骨肉瘤细胞的增殖。除此以外，本研究也对剩余5个化合物Walsuronoid B、Eucalrobusone C、Physakengose G、Physagulide Q、Glycyrrhetinic Acid的抗肿瘤药效进行了评价。（3）从整体、细胞与分子水平三个层次研究了Icariside II抗骨肉瘤增殖作用和机制。Icariside II能通过mTORC1-4E-BP1信号通路抑制了eIF4F蛋白复合物的形成，抑制了“帽”依赖性蛋白质翻译。Icariside II通过mTORC1-4E-BP1和Mnk1信号通路抑制了骨肉瘤细胞中c-myc的蛋白翻译，降低乳酸的生成和葡萄糖的摄取，降低骨肉瘤细胞糖酵解，抑制ATP的生成，进而发挥抗骨肉瘤增殖作用。除此以外，本研究也对剩余5个化合物Walsuron