基于“毒性物质-炮制程度-肝肾毒性”变化规律的蒺藜炒制减毒机理研究

“The change of toxic substances causes the change of drug toxicity” is the essence of the theory “toxicity reducing when processing”. With the wide application of Fructus Tribuli at home and abroad, its toxicity is increasingly valued. Our research found that the main toxic reaction of Fructus Tribuli were liver and kidney damage, and the traditional processing method can reduce the liver and kidney toxicity. So, we infer that Fructus Tribuli processing is accord with the theory of ”toxicity reducing when processing”..In the present study, liver and kidney cell model in vitro and multiple chromatographic separation technology will be used to seek ingredients or components of Fructus Tribuli with the liver and kidney toxicity. Using the method of simulation processing, with the degree of processing for the media, the law of toxic substances changes will be associated with variation of liver and kidney toxicity. So, their correlation will be clear. The changes of ingredients or components with the liver and kidney toxicity will be tested in toasted Fructus Tribuli, so the attenuated mechanism will be explained accurately..The research will provide scientific basis for toasted Fructus Tribuli, and the theory of “toxicity reducing when processing” will be further enriched. This research will be benefit to optimize the processing technology, to improve the quality, to ensure the effectiveness and safety of clinical medication of Fructus Tribuli.

中药“生毒熟减”的根本是其毒性物质发生了变化，而导致受药体毒性反应的强弱变化。随着蒺藜在国内外的广泛应用，其毒性反应日益引起重视，课题组研究发现，蒺藜的毒性反应主要为肝脏、肾脏的损伤，而蒺藜传统的炮制方法“炒制”可降低其肝肾毒性反应，本课题组推断蒺藜炒制符合“生毒熟减”的炮制理论。.因此，本研究：1.拟借助体外肝肾细胞模型以及多种色谱分离技术明确蒺藜肝肾毒性的成分或组分；2.借助模拟炮制研究方法，以炮制程度为媒介将肝肾毒性物质变化规律与肝肾毒性反应变化规律动态关联起来，明确蒺藜肝肾毒性成分或组分在炒制过程中的变化与肝肾毒性反应降低的相关性。通过验证炒蒺藜样品中是否存在模拟炮制中肝肾毒性成分或组分的变化，准确阐明蒺藜炒制减毒机理。.本课题将为蒺藜炒制减毒提供科学性依据，进一步丰富“生毒熟减”的炮制理论，同时，有利于优化蒺藜炮制工艺，提高蒺藜炮制品的质量，保证蒺藜临床用药的有效性和安全性。

前期研究证实蒺藜具有一定的肝肾毒性，炒制后可降低肝肾毒性。但尚不明确蒺藜的肝肾毒性物质及其炒制减毒机理。本项目借助体外肝肾细胞模型和在体动物模型确定蒺藜生物碱提取物和大孔树脂的70%乙醇洗脱物具有肝肾毒性。从70%乙醇洗脱物分离纯化鉴定出5个呋甾皂苷，2个螺甾皂苷，2个甾体皂苷元。以体外肝肾细胞模型检测9个化合物的肝肾毒性，结果发现螺甾皂苷terrestrosin D和25R-tribulosin具有明显的肝肾细胞毒性，呋甾皂苷和甾体皂苷元未表现出肝肾毒性，推断螺甾皂苷是蒺藜中的肝肾毒性成分。采用UHPLC-Q-TOF/MS技术结合多元统计分析和t检验，共鉴定出30个对区分生炒蒺藜具有贡献意义的甾体皂苷，具有规律的是蒺藜炒制后呋甾皂苷（含C-22-OH）和螺甾皂苷的峰强度显著减弱（P＜0.01或0.05），呋甾皂苷（含C-20-C-22位双键）和甾体皂苷元的峰强度显著增加（P＜0.01或0.05）；运用LC-MS/MS技术同时测定生炒蒺藜中9种甾体皂苷的含量，进一步证实了该发现。采用LC-MS/MS测定不同炒制时间-温度条件下9种甾体皂苷含量，确定炮制程度（以炒制温度和时间为参数）—肝肾毒性物质变化规律，结果证实具有肝肾毒性的螺甾皂苷terrestrosin D和25R-tribulosin含量显著降低（P＜0.01或0.05），无肝肾毒性的甾体皂苷元hecogenin和tigogenin含量显著增加（P＜0.01或0.05）。通过螺甾皂苷terrestrosin D和25R-tribulosin单体化合物的模拟炮制探讨了炮制过程中含量变化的机制：terrestrosin D和25R-tribulosin在加热炮制过程中发生脱糖反应，脱糖反应优先发生于糖链的末端糖，随后由外向内依次脱去糖链上的多个糖基，最后生成相应苷元。综上所述，本项目研究发现螺甾皂苷terrestrosin D和25R-tribulosin是蒺藜中的肝肾毒性成分，在蒺藜炒制过程中可转化为几乎无肝肾毒性的甾体皂苷元。螺甾皂苷的“脱糖减毒”是蒺藜炒制降低肝肾毒性的因素之一。本项目的研究将为蒺藜炒制减毒的科学性提供依据，进一步丰富“生毒熟减”的炮制理论，同时有利于筛选蒺藜的炮制工艺、完善蒺藜生炒品的质量标准，保证蒺藜临床用药的有效性和安全性。