锁核酸靶向诱导基因启动子形成G-四链体的机制

以凝血酶适配体（thrombin binding aptamer，TBA）的G-四链体为分子模型，研究锁核酸（locked nucleic acid，LNA）修饰与TBA的G-四链体结构稳定性之间的内在关系，揭示LNA修饰的富含G寡核苷酸进行核酸链置换的分子机制。以此为基础，在分子水平和细胞水平上，进一步探讨原癌基因Bcl-2启动子P1中富含鸟嘌呤的G岛在形成G-四链体结构的规律，以LNA修饰的G岛序列制备靶向分子，通过核酸链置换诱导P1启动子的G岛形成稳定的G-四链体结构，从而抑制Bcl-2基因的表达，实现利用外源性核酸分子对基因实施靶向调控的目的。该研究为探寻肿瘤发生机制、研究基因表达调控以及设计全新的靶向药物提供可靠的实验数据和理论基础。

本课题组已经圆满地完成了项目标书中的三项预定任务。.第一，以凝血酶适配体（TBA）为G-四链体结构的分子模型，制备了二个系列的核苷酸衍生物OMeN (2’-O-methyl nucleic acid) 和FNA（2’-Fluro nucleic acid）定点修饰的TBA，研究了核苷酸的糖苷键构象以及戊糖环构象与G-四链体结构稳定性之间的内在关系，研究了K+和Ca2+在调控G-四链体拓扑结构中的作用，研究了核苷酸修饰与TBA凝血酶活性中作用。实验结果表明，顺式糖苷键和反式糖苷键的定点修饰可以改变G-四链体结构的稳定性；OMeN修饰可以降低稳定性，而FNA可以增强稳定性；K+增强了结构的稳定性，而Ca2+导致了反平行的G-四链体向平行G-四链体的构象转变；G-四链体的结构改变可以直接影响了TBA的凝血酶活性。这些结果不仅显示了TBA潜在的抗凝抗栓的药物作用，而且还揭示了G-四链体结构稳定性的内在关系，为制备具有核酸链置换分子机制的靶向开关分子奠定了实验基础。.第二，探讨原癌基因c-met启动子中富含鸟嘌呤的序列形成G-四链体结构的机制以及G-四链体形成的生物学效应。基于生物信息学分析，确认了可能生成G-四链体结构的序列，以此序列为基础，制备了各种截断序列的模型，利用CD光谱、非变性电泳分析和PCR-STOP实验研究了体外条件下c-met启动子所形成G-四链体的拓扑构象和结构稳定性，利用双荧光素酶实验、western blot、流式细胞学、细胞迁移运动和qRT-PCR实验研究了体内条件下c-met启动子的形成、表达特性以及生物学效应。结果表明，c-met启动子中富含鸟嘌呤的序列具有形成G-四链体结构的可能性；利用外源性配体可以诱导细胞内c-met启动子形成G-四链体结构；c-met启动子形成G-四链体结构后可以下调基因的表达，促进细胞的凋亡并抑制细胞的迁移。该研究为探寻肿瘤发生机制、研究基因表达调控以及设计全新的靶向药物提供可靠的实验数据和理论基础。.第三，由于国内生物公司的LNA专利受权问题，我们无法得到预定的核苷酸衍生物，因此，在不改变原研究目的的前提下，对原研究计划做了一定的修改。我们研究了人工合成的G-四链体在肿瘤治疗方面的可行性，观察到了某种特殊的G-四链体可以有效地抑制耐药卵巢癌的增殖，利用分子生物学方法确认了G-四链体的作用是下调了耐药基因的表达，增强了对