丁香假单胞菌冰核蛋白跨膜分泌效应分子的研究

本课题以具高冰核活性的丁香假单胞菌MB03菌株为对象，拟研究影响该菌冰核蛋白INP跨膜分泌转运性能的细胞内源效应分子及其活性。通过将MB03菌株冰核基因inaQ的N-端结构域与绿色荧光蛋白基因gfp和inaQ的C-端构建融合基因并导入MB03菌株后，筛选具有GFP细胞壁表面锚定活性、具有筛选标记且方便检测的染色体整合重组菌；再经由转座子Tn5介导的插入突变，构建该整合重组菌的Tn5插入突变文库，并从该文库中通过检测细胞壁和细胞质中GFP荧光活性值的变化，来筛选可影响InaQ-GFP分泌和表面锚定的发生增强效应和减弱效应的突变子，从中再进一步采用锚定PCR、蛋白质组学与质谱分析等，筛选并确定1－2种影响INP分泌与细胞壁锚定活性的增强和减弱效应分子，研究其编码基因的结构与活性。最后通过分别导入额外增强效应基因和剔除减弱效应基因到相应突变子中，对这些效应分子进行增强或者减弱效应的验证。

丁香假单胞菌所产生的冰核蛋白（Ice Nucleation Protein）是引发宿主植物冻害的效应蛋白，但对其跨膜分泌活性与机制缺乏研究。本项目在克隆一株高冰核活性菌株冰核基因inaQ和构建多种细胞表面展示系统的前期工作基础上，对影响该蛋白跨膜分泌的效应分子与作用机制进行了研究。首先利用全长和不同长度截断片段的InaQ作为锚定基序和用绿色荧光蛋白作为报告蛋白构建了多种细胞表面展示系统，对影响丁香假单胞菌MB03菌株所产生的InaQ蛋白的跨膜分泌转运的结构域、影响因子与多重运载蛋白组合的跨膜分泌效应进行了测定，确定了直接决定该蛋白跨膜分泌的蛋白质结构域属性。然后，通过建立体外免疫学检测系统、转座突变系统和测定MB03菌株的全基因组序列等，对影响InaQ跨膜分泌转运的增强与致若效应分子进行了筛查。对MB03菌株改造建立了一种方便检测和转座效率高的mini-Tn5转座突变系统并获得含1265株突变株的转座突变文库，利用ELASA和原位杂交法从中初筛到InaQ分泌活性改变的突变株40株，并进一步用流式细胞仪测定复筛到活性明显改变的增强突变株5株和减弱突变株4株。利用Tail-PCR技术并结合与基因组序列的比对，确定了柠檬酸合成酶基因等4个突变株的宿主菌染色体转座插入位点。构建了inaQ基因启动子区域5个不同删除组合片段并测定了其对转录活性的影响，发现小分子活性物柠檬酸盐和3,5-二硝基水杨酸等具有增强InaQ表达与分泌的活性。结合全基因组序列预测分析，发现inaQ基因上游调控基因gntR对inaQ具有负调控作用。通过EMSA、DNA酶足迹法、免疫共沉淀（ChiP）试验和全基因组ChIP测序等研究，确定并证实了gntR与inaQ启动子区域的结合，对结合部位进行了精确定位分析，并对Cu离子、小分子效应物对GntR-inaQ启动子的结合活性的影响进行了测定。利用体外ITC试验测定了柠檬酸盐对GntR蛋白的结合作用。由此提出了小分子活性物柠檬酸盐是通过与GntR的结合而减弱了后者对inaQ启动子的结合活性，导致InaQ表达与分泌量的增加的分子机制。在InaQ蛋白分泌活性应用方面，分别构建了表面展示高丝氨酸内酯酶、多铜氧化酶、金属硫蛋白、有机磷水解酶的展示系统，并分别用于植物软腐病防治、合成染料脱色、重金属吸附和有机磷化物降解的活性系统构建与测定。