丁香假单胞菌III型分泌系统组分HrpH的多功能解析

As a species, Pseudomonas syringae causes economically important diseases in a wide range of plant species. P. syringae translocates a large range of virulence/avirulence effectors into plant cells to cause disease or trigger innate immunity while the effector delivery is comprehensively subject to the type III secretion system encoded by hrp/hrc genes. hrpH gene is located between hrpR and avrE1 in the hrp pathogenicity island and predicted encoding a multi-domain lytic transglycosylase which is coregulated with the type III secretion system in P. syringae. The previous research reported that HrpH was involved in effector translocation but not secretion. Here we aim to decipher the mechanisms of HrpH involving in T3SS translocation and interacting with plants. In this study, the predicted domain architectures of HrpH will be cloned and determined for its secretion, translocation, and promotion of effector translocation through the type III secretion system. A combined strategy of purification of HrpH protein with Agrobacterium-mediated transient expression of HrpH in plant apoplast and cytoplast will be deployed to determine the capacity of HrpH triggering cell death and promoting effector translocation. This project will generate a broad understanding on the mechanisms of T3SS translocation, which could be positioned to explore new management strategies applying to plant bacterial disease. Another important aspect of the project is to enrich and improve the knowledge of lytic transglycosylase, which could provide references not only for phytobacteriology but also for human and animal bacteriology.

丁香假单胞是研究III型分泌系统的模式细菌，可以与多种植物互作。效应蛋白通过III型分泌系统转运进入植物细胞产生致病或免疫反应，因此深入了解III型分泌系统的转运和致病机制具有重要的科学意义。HrpH是丁香假单胞中受III型分泌系统调控、具有多个结构域的裂解性转糖基酶（SLT），在效应蛋白转运过程中起关键作用。本项目将深入研究HrpH蛋白的多功能特性，通过对其多结构域的深入分析，阐明其自身分泌与转运的方式、参与调节和控制III型分泌系统效应蛋白转运的机制、以及与植物互作的分子基础。HrpH的功能解析是III型分泌系统相关研究的重要组成部分，将有助于了解III型分泌系统作用机理的科学问题，为防治植物细菌病害提供更多的思路和策略。同时，HrpH多功能特性的研究也会丰富对裂解性转糖基酶类蛋白家族的认识，不仅对植物病原细菌学研究有借鉴意义，还可以为人体或动物病原细菌的相关研究提供参考。

III型分泌系统（Type III secretion system, T3SS）是植物病原细菌效应蛋白的主要输出通道，能将效应蛋白转运进入植物细胞产生致病或免疫反应，因此深入认识T3SS的转运、致病或免疫机制具有重要科学意义。已知T3SS主要由hrp/hrc组分构成，但hrp/hrc组分除了参与T3SS组装和调控之外，是否能够泌出细菌胞外与植物互作从而调控效应蛋白输出和植物免疫？这是长期以来尚未解决的重要科学问题。本项目以丁香假单胞番茄致病变种Pseudomonas syringae pv. tomato（Pst）DC3000 T3SS组分HrpH为材料，研究发现T3SS特异化的SLT类蛋白HrpH可以结合肽聚糖、裂解细胞壁，且第148位的谷氨酸是影响结合作用的关键位点。进一步研究发现SLT结构域是HrpH调节与控制T3SS转运效应蛋白的关键功能域。利用纯化的HrpH及其功能结构域蛋白注射烟草和番茄叶片，发现HrpH及其功能结构域蛋白均能够激发植物细胞坏死和抑制PTI。转hrpH基因拟南芥结果显示，HrpH在植物体内可以抑制由flg22或elf18诱导的活性氧爆发和胼胝质积累，以及增强植物对T3SS突变体Pst DC3000ΔhrcC的感病性。转录组分析结果显示，HrpH能够抑制水杨酸和茉莉酸信号分子途径。通过番茄酵母cDNA文库筛选发现，HrpH与一个E3泛素连接酶ATL2存在互作关系，并利用双分子荧光互补试验进一步验证了两者的互作。同时研究发现，HrpH依赖其SLT结构域与ATL2产生互作。利用病毒介导的基因沉默技术在烟草体内沉默了ATL2基因，结果发现HrpH蛋白在ATL2基因沉默植株上丧失了激发细胞死亡的能力，且ATL2基因沉默植株表现出更强的感病性。进一步研究发现，沉默ATL2基因并不影响HrpH抑制由flg22诱导的活性氧爆发的能力，但显著影响HrpH抑制MAPK信号组分基因表达的能力。这些研究表明，HrpH一个多功能的T3SS组分，HrpH不仅可以通过裂解细胞壁、结合肽聚糖从而协助T3SS 穿透细菌细胞壁形成超分子复合体，还可与定位于植物质膜的E3泛素连接酶互作调节植物免疫。这些发现丰富了对SLT类蛋白家族蛋白和T3SS以及病原细菌和植物互作的认识和理解，不仅对植物病原细菌学研究有借鉴意义，还可为人体或动物病原细菌的相关研究提供有益参考。