HBHA蛋白对AECⅡ细胞自噬抑制作用的机制研究

HBHA是结核菌早期感染与播散过程中的重要毒力分子。在感染上皮细胞时表达明显增强，缺失表达的结核菌则黏附和感染能力显著下降。但目前其介导感染和播散的生物学效应机理尚未完全明确。本课题组已证实肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬可防御结核分枝杆菌感染；并发现HBHA除了已知的黏附作用外，还具有抑制AECⅡ细胞自噬的作用，因此，HBHA可能是通过黏附和抑制自噬两种机制介导结核分枝杆菌的感染与播散。基于上述研究基础，本课题拟进一步明确HBHA蛋白的功能，通过构建不同的缺失突变体证明其抑制自噬的结构域，鉴定HBHA与自噬体相互作用的信号通路和靶分子，阐明该抑制作用对结核感染和播散的影响，探讨自然免疫机制抵抗HBHA介导的感染的作用，为研制针对HBHA蛋白的疫苗和以之为靶点开发抑制性药物奠定基础。

HBHA蛋白是结核菌早期感染和播散的一个重要的毒力因子。为了阐明HBHA蛋白在结核菌播散过程与自噬作用的分子机制，本研究首先表达纯化了重组HBHA蛋白，并提取了天然HBHA，制备了抗HBHA多克隆抗体；以自噬抑制剂3-MA和 RNAi方法抑制细胞自噬功能，探讨自噬在结核菌感染中的作用；观察了HBHA对肺泡II型上皮细胞A549自噬的影响；继而研究了HBHA在结核菌引起的A549细胞坏死过程的作用；原核表达HBHA-△C、 HBHA-△N和HBHA-△α螺旋区蛋白，研究参与抑制自噬作用的HBHA结构域；并构建表达了HBHA缺失的分枝杆菌，观察△HBHA与AECⅡ自噬体的相互作用；对IL-1β、IL-6、IL-19、TNF-α和IFN-γ五种细胞因子释放量做了检测，通过高通量shRNA技术筛选出HBHA介导炎性反应的炎性信号通路。结果显示，A549细胞自噬的抑制可以导致结核菌引起的细胞坏死程度增强；HBHA可以抑制细胞自噬的成熟，使得自噬相关蛋白LC3表达减低；缺失N端或C端的HBHA不能发挥对LC3的抑制作用，HBHA发挥抑制自噬作用的活性结构域为α螺旋区；HBHA引起的A549细胞自噬抑制可以增强结核菌引起的细胞坏死；抗HBHA抗体可以在一定程度上抑制结核菌引起的A549细胞坏死，缺失了HBHA的菌株作用后LC3的表达无变化，而野生型的菌株作用后LC3的表达量会随浓度增加下调。从而证明，HBHA具有抑制细胞自噬的功能，在结核菌引起细胞坏死并播散过程中发挥着重要作用。因此，HBHA作为一种潜在的疫苗，具有重要的应用价值。