基于Dkk-1抑制作用的牛膝抗骨质疏松症的药效物质基础研究

Radix achyranthis bidentatae (RAB) has been widely used in clinic to treat osteoporosis (OP). In previous work, the 50% ethanol elution constituents through macropore adsorbing resin of RAB have been determined as the effective fraction for treating OP. The Niuxixinsterone(NXXS) compounds were isolated from the effective fraction and discovered to have targeting inhibitory effects to Dickkopf-1(Dkk-1). On the basis of previous work and the combination of advanced multidisciplinary methods and technology, we aim to systematically investigate the effective substances of inhibiting of Dkk-1 action for treating OP. Based on the methodology integrated UHPLC-Orbitrap, NMR, a variety of chromatography technology and spectroscopic approaches, NXXS compounds will be rapidly screened, isolated and identified. Application of DS software, rhDkk-1-OB and osteoporosis rat model, we will screen target compounds of inhibiting against Dkk-1 protein. Base on the molecular docking, molecular interaction and site-specific mutagenesis technology, we will illuminate the binding site and bonding form between NXXS compounds and Dkk-1, reveal the the mechanism of inhibiting of Dkk-1 action and obtain the Dkk-1 inhibitor with significant activity and clear functional mechanism. This research will deepen the understanding of traditional efficacy of RAB and enrich the theory of TCM. In this way, our findings will establish solid scientific foundation for the development of new anti-osteoporosis drug based on Dkk-1 target.

牛膝为治疗骨质疏松症(OP)的常用中药，在已确定牛膝抗OP有效部位及牛膝新甾酮(NXXS)类化合物具有靶向抑制Dkk-1活性的基础上，整合中药化学、药理学，分子生物学及分子信息学等先进科学技术与手段，对牛膝抑制Dkk-1抗OP的药效物质基础进行研究。采用UHPLC-Orbitrap和NMR技术对NXXS类化合物快速识别后分离鉴定。应用DS软件分析该类化合物与Dkk-1的构效关系，并结合rhDkk-1-成骨细胞模型和OP大鼠模型，筛选抑制Dkk-1活性显著的先导化合物。利用分子对接、分子互作以及定点突变技术，阐明NXXS类化合物与Dkk-1的结合位点和结合方式，揭示其抑制Dkk-1蛋白的作用机制，获得活性显著且作用机制清晰的Dkk-1抑制剂。本研究项目可深化对牛膝传统功效的认识，丰富中医药学内容，并可为研制出疗效好、具有自主知识产权，以Dkk-1蛋白为靶点的新型抗OP药物奠定坚实的科学基础。

本项目在确定了牛膝抗OP有效部位的基础上，应用UPLC-Q-TOF-MS对牛膝有效部位中化学成分的组成进行了快速识别分析，发现了结构新颖的牛膝新甾酮(NXXS)类化合物，通过观察其碎片离子，总结了NXXS类化合物结构特点和质谱裂解规律。并对有效部位进行了系统深入的化学成分研究，共分离鉴定了50个单体化合物。建立了新生大鼠颅骨成骨细胞模型，考察了NXXS类化合物体外促进新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化、矿化以及对Wnt/β-catenin信号通路中重要蛋白表达量的作用，并获得量效关系，筛选出了通过抑制Dkk-1蛋白活性从而发挥抗OP作用的NXXS类先导化合物。建立了去势OP大鼠模型，综合分析了活性先导化合物对血清中与骨代谢相关的生化指标、OP大鼠股骨显微结构特征及Wnt/β-catenin信号通路中重要蛋白表达量的影响，确证了其抗OP的作用。应用Autodock分子对接程序计算了NXXS类化合物与Dkk-1蛋白的分子对接情况，获得了NXXS类化合物与Dkk-1蛋白分子结合的最佳构象，结合位点和结合方式。利用SPR技术，将Dkk-1蛋白固定在芯片上，分析了NXXS类化合物与该蛋白的亲和力，评价了它们相互作用的强弱。采用定点突变技术，获得纯度较高结合位点突变的Dkk-1蛋白，利用SPR技术，将突变的Dkk-1蛋白固定在芯片上，对比该类化合物与突变前后Dkk-1蛋白的亲和力，确证了结合位点。本项目在阐明牛膝抗OP药效物质基础的同时，发现具有新药开发前景的先导化合物，为NXXS类化合物作为新型Dkk-1抑制剂的研发提供理论基础，进而为阐释牛膝补肾壮骨的中医理论，充分开发利用其药用资源和研制开发具有自主知识产权抗的靶向抗OP药物提供科学的参考依据。