视网膜脱离后TNF-α对光感受器细胞自噬的调控作用研究

Photoreceptor cell death is the ultimate cause of vision loss in various retinal disorders, including retinal detachment (RD), age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa. The photoreceptor death plays critical role in the blindness causation but the mechanism is still unclear. Retinal detachment is the ideal model to investigate the photoreceptor death.Photoreceptor cell death has been thought to occur mainly through apoptosis, which is the most characterized form of programmed cell death. But anti-apoptosis could not prevent the photoreceptor death thoroughly. Recent accumulating evidence demonstrates that non-apoptotic forms of cell death, such as autophagy, also regulates the photoreceptor death. Autophagy can protect photoreceptors from death, but over activated autophagy will cause cell death. The inflammation factors, such as, TNF-alpha, IL-2, IL-6, were involved in the photoreceptor autophagy after retinal detachment.In this study, we will use retinal detachment animal model and cultured photoreceptor cells, to study the autophagy both in vivo and in vitro, and to investigate its effect in photoreceptor death.We will clarify the pathology of photoreceptor death after retinal detachment through intervention of autophagy and TNF-αexpression by Atg5 knockout mice and medications. And further，look for efficient way to improve the strategy for photoreceptor protection after retinal detachment.

光感受器细胞死亡是视网膜脱离、年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性等很多致盲性眼病的共同病理改变，是导致视力丧失的关键因素，这些疾病光感受器细胞死亡的机制不清。视网膜脱离是研究光感受器细胞死亡的理想模型，以往的研究多集中在凋亡方面，但是即便阻止凋亡的发生也不能完全保护光感受器细胞的丢失。近年研究发现自噬在光感受器细胞的生存和死亡中发挥着重要的作用，自噬可以保护细胞，但是过多的自噬又可以导致细胞死亡。而且TNF-α、IL-2、IL-6等炎性因子在视网膜脱离后光感受器细胞的自噬中具有一定的调节作用。本研究拟利用视网膜脱离的动物模型和培养的光感受器细胞损伤模型，研究光感受器细胞自噬的发生，以及与细胞存活和死亡方式的关系，并试图通过调控视网膜脱离后TNF-α的表达，改变自噬的进程，探讨视网膜脱离后光感受器细胞的自噬从细胞保护转化成细胞死亡的机制，进一步探讨视网膜脱离后光感受器细胞保护策略。

光感受器细胞为终末分化细胞，受损后无法再生，但目前对其死亡机制尚不清楚，故对其死亡机制进行探讨对于治疗相关视力损伤具有重要意义。视网膜脱离（retinal detachment, RD）是常见致盲性眼病，尽管手术技术日臻完善，但术后视力恢复欠佳。细胞死亡形式主要有凋亡、自噬和坏死，而一直以来，TNF-a 在RD后光感受器细胞死亡过程中的作用已是不争的事实，因此对TNF-a 进行调控可能是保护光感受器细胞的有效手段。本研究建立了光感受器细胞系损伤模型和小鼠RD模型，定性定量分析RD后不同阶段光感受器细胞的形态学和功能学改变。离体条件下，使用2.0 ug/ml的抗Fas抗体刺激661W细胞，凋亡水平6 h时增加，12 h达高峰，并持续至48 h，与此同时自噬3 h时增加，24 h达高峰，48 h时降至基线水平；使用20 nmoL/L的3-甲基腺嘌呤、2.0 nmol/L的雷帕霉素抑制或增强自噬，发现单独使用3-甲基腺嘌呤或雷帕霉素对细胞的生存状态没有明显影响，而若再添加抗Fas抗体，凋亡分别出现升高或降低的趋势，从而得出抗Fas抗体诱导661W细胞凋亡时，增强自噬可降低细胞凋亡率，抑制自噬则会增加细胞凋亡率的结论。在体情况下，我们通过在C57BL/6J小鼠视网膜下注射2 ul透明质酸钠建立RD模型，并分别于RD后1、3、5、7天分离视网膜组织，发现RD 1 d时即可检测到凋亡细胞，3 d时达高峰, 7 d后急剧减少，自噬则在1 d至3 d增加，7 d时减少； 与正常对照组相比，TNF-a在RD 1 d达高峰，3 d时减少，7 d时恢复正常，而英夫利昔+RD组1 d时TNF-a水平未增加；RD 3 d，英夫利昔+RD组自噬虽升高但幅度较低，且RD 7 d，自噬仍保持在高表达水平；此外，RD 3 d，英夫利昔组较生理盐水组光感受器细胞凋亡的数目减少，从而得出RD后，TNF-a可提高细胞自噬，延长自噬活性，抑制TNF-a，自噬活性改变，光感受器细胞凋亡减少的结论。本研究为研究不同自噬与TNF-a水平下细胞的生存状态提供了更清晰、直观的实验基础，为RD的可能疗法提供了新视角。