Col-I/PVA复合材料诱导自体BMSCs再生形成ACL机制研究

Anterior cruciate ligament (ACL) injury is a common clinical disease, tissue engineering strategy provides new insights for ACL regeneration and repair. We previously found that ACL regeneration can be achieved 6 months after implantation of Col-I/PVA fiber composites into ACL rupture site, but its underlying mechanism is still unknown. In combination with recent research progress, here we hypothesize that after implantation, adhesion proteins in the bone marrow attach to the Col-I/PVA composites, followed by specific binding of RGD ligand to the integrin receptors of BMSCs. Then, the chain "RGD ligand-integrin receptor-cytoskeleton-signaling molecule" is formed to closely connect the implanted material and BMSCs. This chain mediates the interaction between implanted materials/microenvironment and cells, regulates BMSCs proliferation and differentiation into ACL fibroblasts. To test this hypothesis, in this project, firstly we aim to identify adhesion proteins and elucidate the mechanism of BMSCs-material adhesion by co-culturing implanted materials with cell-free bone marrow aspirates or BMSCs, and examining the active ligand-integrin receptor binding. Secondly, we aim to clarify the mechanism of material implantation induced BMSCs proliferation and differentiation by applying mechanical and/or growth factor stimulation to mimic the in vivo physical and chemical microenvironment, and investigating the related signaling pathways. The findings of our project will be able to provide new insights and approaches to the treatment of ACL injury.

前交叉韧带损伤临床常见，组织工程技术为实现其再生提供了新思路。项目组研究发现，单纯植入Col-I/PVA复合纤维编织材料，术后6个月即观察到新生ACL形成，但其机制不清。结合最新进展我们推测：材料植入体内后骨髓中的粘附蛋白首先吸附在材料表面，然后通过特异性RGD配体与BMSCs表面整合素受体结合，在材料与细胞之间形成一条“RGD配体-整合素受体-细胞骨架-信号分子”复合链，介导材料及微环境与细胞之间的相互作用，从而调控BMSCs增殖、分化形成新生ACL。据此，本项目拟采用骨髓液、BMSCs与材料共培养方法，通过对粘附蛋白鉴定及RGD配体与整合素受体结合情况研究，首先明确粘附蛋白种类、阐明细胞与材料之间的粘附机制；然后模拟在体微环境中的理化因素，在细胞与材料共培养过程中施加力学和因子刺激，通过对增殖、分化密切相关信号分子研究，阐明BMSCs增殖及分化机制，为ACL损伤治疗提供新理论、新方法。

韧带撕裂或断裂在临床医学中比较常见,常规的治疗方法为自体或异体肌腱的移植以及LARS韧带重建术。目前处于研究阶段的组织工程人工韧带是以再生医学方式治疗韧带损伤最为理想的新思路。虽然，现有的组织工程韧带能一定程度的修复受损韧带，但其修复机制尚不明确：参与韧带重建的BMSCs对材料的粘附作用及材料诱导BMSCs分化的机制是影响修复效果的关键。因此，课题组在前期研究BMSCs与材料粘附作用的基础上，引入了具有干细胞募集作用的适配体APT19S，用天然蚕丝纤维代替原先的Col-I/PVA复合纤维。实验结果表明：在体外实验中，将适配体通过化学键交联至蚕丝纤维后，蚕丝纤维对BMSCs的募集能力明显增强，且适配体的使用并不影响蚕丝纤维良好的生物相容性，使用现有工艺编制的直径7mm的蚕丝韧带力学强度大于3000N;新西兰兔韧带重建实验中，适配体修饰的蚕丝韧带植入的前1,2周，参与修复的BMSCs数量明显提高，长期修复效果优于无适配体韧带。本研究结果提示：适配体的使用提高了参与修复的BMSCs数量从而加快韧带再生的速度,而用蚕丝纤维代替Col-I/PVA复合纤维能提高人工韧带的力学性能和生物学性能。此外，在本项目的研究中，我们探索性的制备了丝素蛋白/壳聚糖凝胶、适配体修饰的丝素蛋白复合支架来解决韧带重建过程中止点部分软骨修复可能遇到的问题，研究了可能参与止点软骨修复的髌下脂肪垫干细胞受炎性环境影响后的分化能力、斑联蛋白对软骨细胞分化的影响。