平目汤及拆方调控Graves眼病球后脂肪细胞积聚机制研究

Graves眼病为主要致盲原因之一。其中严重影响患者生命质量的非活动期Graves眼病属顽固性疾病，尚无有效内科治疗方法。前期平目汤治疗非活动期Graves眼病随机、双盲临床研究显示，平目汤有效降低非活动期Graves眼病突眼度，总有效率77.14%。在此基础上进行眼眶脂肪细胞培养，根据平目汤全方及按益气、温阳、化痰祛瘀治则拆方，以地塞米松为对照分别观察平目汤，黄芪，仙灵脾，丹参+白芥子+车前子+白花蛇舌草，黄芪+仙灵脾，黄芪+丹参+白芥子+车前子+白花蛇舌草，仙灵脾+丹参+白芥子+车前子+白花蛇舌草等含药血清对重组人瘦素蛋白诱导的眼眶脂肪细胞增值的影响；促进眼眶脂肪细胞凋亡的作用；Caspase-3、8、9等活性及基因表达。从导致Graves眼病发生、发展、慢性化进程最重要的眼球后脂肪积聚途径，探讨平目汤2号作用机理和靶点，凋亡的途径，最有效治则及药物，为中药治疗该病奠定基础。

研究平目汤及拆方对Graves眼病眼眶前脂肪细胞增殖和成熟脂肪细胞凋亡的影响，探讨平目汤治疗非活动期Graves眼病的作用机理及具体靶点。体外培养Graves眼病患者眼眶前脂肪细胞，鉴定并传代。诱导前脂肪细胞分化，油红O染色鉴定成熟脂肪细胞。将平目汤拆方为益气组、温阳组、化痰祛瘀组、益气+温阳组、益气+化痰祛瘀组、温阳+化痰祛瘀组，制备全方组及各拆方组含药血清。MTT法观察平目汤及拆方对前脂肪细胞增殖活性的影响；流式细胞术测定平目汤及拆方对成熟脂肪细胞凋亡率的影响。；Western blot检测平目汤及拆方对Cleaved Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达的影响；Real Time-PCR（RT-PCR）检测平目汤及拆方对Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达的影响。结果发现原代培养细胞呈梭形，间接免疫荧光检测鉴定培养细胞为前脂肪细胞，细胞可分化为成熟脂肪细胞。平目汤及各拆方组均可降低前脂肪细胞增殖活性，其中平目汤（全方）组最为显著，益气+温阳组其次。平目汤（全方）组、化痰祛瘀组、益气+温阳组、益气+化痰祛瘀组、温阳+化痰祛瘀组作用12d 后OD值出现明显差异，作用16d后更为显著，地塞米松组差异无统计学意义。与空白对照组相比，平目汤（全方）组、益气+温阳组、益气+化痰祛瘀组、温阳+化痰祛瘀组的细胞凋亡率均升高，其中平目汤（全方）组凋亡率最高（10.5±1.45），益气+温阳组（9.9±0.60）其次。与空白对照组相比，各治疗组除化痰祛瘀组外Cleaved Caspase-3蛋白表达均上调，其中平目汤（全方）组最为显著，益气+温阳组其次；各治疗组Cleaved Caspase-8蛋白表达均上调，其中平目汤（全方）组最为显著，益气+温阳组其次；各治疗组Cleaved Caspase-9蛋白表达均上调，其中平目汤（全方）组最为显著，益气+化痰祛瘀组其次。空白对照组和各治疗组可检测到Caspase-3 mRNA、Caspase-8 mRNA以及Caspase-9 mRNA，各治疗组与空白对照组比较无明显差异。由此可见，平目汤及拆方对非活动期Graves眼病眼眶脂肪细胞积聚有不同的作用，全方组有整体优势。