利用条件性基因敲除小鼠研究ANGPTL4在肝癌发生中的作用及机制

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies and a leading cause of cancer-related mortality in the world. In 2008, half of all new cases of liver cancer and related deaths worldwide were estimated to occur in China. Tumor recurrence and metastasis are the main causes of death in patients with HCC. Accumulating evidence suggests that tumor metastasis is a complex process influenced by multiple procedures and multiple mediators in human cancers; however, the biology controlling HCC metastasis remains poorly understood. It is very important and necessary to explore the molecular mechanisms in HCC development and to find effective treatment strategies. Angiopoietin-like protein 4 (ANGPTL4) plays complex and often contradictory roles in vascular biology and tumor metastasis. In our previous study, we found ANGPTL4 acts as an important regulator in the metastasis of HCC. serum ANGPTL4 is higher in HCC patients, compared to healthy control, and correlates with tumor progression and intrahepatic metastasis and might be used to indicate prognosis in HCC patients. It means that ANGPTL4 plays very important roles in hepatocarcinogenesis and progression. In the present project, we will explore the function of ANGPTL4 on hepatocellular carcinogenesis by using ANGPTL4 conditional knockout mice model.Then, we will try to identify the ANGPTL4 receptor involved in HCC development by using Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and co-immunoprecipitation (Co-IP). This project will expound the function and mechanism of ANGPTL4 in hepatocellular carcinogenesis and provide the necessary experimental basis and the correct guidance to effective treatment, prevention of recurrence and metastasis as well as the prognosis of HCC.

肝癌是我国发病率和死亡率均很高的一种恶性肿瘤，探索肝癌发生发展的分子机制，寻找有效治疗肝癌的策略是一项重要的课题。 血管生成素样蛋白4(ANGPTL4）与血管新生、肿瘤生长和转移有着密切的关系。我们研究发现ANGPTL4能够影响肝癌细胞生长和体内外转移；尤其是在肝癌患者血清中ANGPTL4水平显著升高，而伴发肝内转移的肝癌患者血清ANGPTL4水平更高,预示ANGPTL4在肝癌发生发展中具有重要的生物学功能，但尚未见ANGPTL4影响肝癌发生的报道，而且由于ANGPTL4在肝癌细胞中的受体尚不明确，其作用机制的研究并不深入。 本项目拟利用条件性敲除小鼠为模型，进一步研究ANGPTL4在肝癌发生中的功能。同时利用免疫共沉淀和质谱检测等技术，筛选并鉴定ANGPTL4受体，深入探索ANGPTL4在肝癌发生发展中的功能及机制，以期为肝癌的有效治疗、预防复发转移及预后提供可靠的实验依据和理论指导。

ANGPTL4是本实验室在以细胞生长为基础的功能基因筛选中，克隆得到的与血管新生素相关的基因。我们实验室在前期工作中首先发现并证实ANGPTL4基因能够影响肝癌细胞系的生长，并且ANGPTL4在肝癌细胞系中表达量的不同导致ANGPTL4发挥抑制或促进生长的相反作用。进一步研究发现缺氧诱导因子HIF-1α可以上调ANGPTL4的表达，进而通过VCAM-1/ Integrin beta 1促进肝癌细胞跨血管内皮细胞迁移和小鼠体内的肝内转移和肺转移。为进一步深入探索ANGPTL4在肝细胞癌发生发展中的功能及机制，我们在该项目的前期工作中建立了条件性ANGPTL4基因敲除小鼠模型。. 本项目实施过程中，对前期构建的条件性ANGPTL4基因敲除小鼠进行了背景纯化并大量繁殖，成功获得项目开展所需的小鼠，观察了ANGPTL4基因敲除小鼠的脏器发育情况和功能的改变以及自发性肿瘤形成情况；并利用DEN和TCPOBOP以及高脂饮食诱导观察ANGPTL4敲除对小鼠肝癌易感性的影响。为探索ANGPTL4影响肝细胞癌发生发展的机制，通过对ANGPTL4-/-和ANGPTL4+/+小鼠肝组织和诱导肝癌组织进行cDNA芯片检测和RNA测序分析，筛选得到差异基因ORM2、SOCS2和PEDF，并对其在肝细胞癌发生发展中的功能及机制进行了研究，结果表明：① ORM2能够抑制肝细胞癌细胞的迁移侵袭能力，其在肝细胞癌组织中的表达与患者的肝内转移和组织学分级呈负相关；在肝细胞癌细胞中C/EBPβ可以明显上调ORM2的表达并通过ORM2抑制肝细胞癌细胞的迁移侵袭，两者在肝细胞癌组织中的表达呈正相关。② 临床样本分析表明SOCS2在肝细胞癌组织中的表达与组织学分期及肝内转移负相关，体内外实验表明SOCS2能够抑制肝细胞癌细胞系体外迁移和侵袭以及动物体内转移。③ PEDF高表达预示患者生存期较短。本项目首次证实PEDF能够通过ERK信号通路促进肝细胞癌的侵袭、转移和EMT。我们以此为实验基础申报2016年国家自然科学基金项目并获得资助（PEDF促进肝细胞癌转移的功能及分子机制研究，81672832）。. 本项目的顺利完成，为阐述肝癌发生发展的机制，肝癌的有效治疗、预防复发转移及预后提供了可靠的实验依据和理论指导。