基于TLR4抑制作用的民族药蝉翼藤抗类风湿性关节炎药效物质基础研究

Rheumatoid arthritis (RA) belongs to arthromyodynia category in TCM. Securidaca inappendiculata Hassk. (SI) is a traditional medicine mainly curing heat type arthralgia used in South China. Xanthone (XAN) was proven as an important active compound in SI, which can efficiently regulate NF-κB and MAPKs pathways, and inhibit proliferation and secretion of fibroblast-like synoviosytes (FLS). Based on previous research results and documents, we assume that some aromatic derivatives including XAN with α,β-unsaturated carbonyl moieties in SI could bind to TLR4/MD-2 as Michael receptors and inhibit the activation of the following signalings in FLS, and afford therapeutic benefits on RA. “Component knock-out & knock-in” strategy combined with histological, immunohistochemistry, PCR and ELISA analyses are employed in this study to evaluate the therapeutic efficacy of total aromatic derivatives (TAD) from SI on collagen induced arthritis mice. We also attempt to screen out active components with high affinity to TLR4 using cell membrane chromatography technique, clarify the chemical composition of TAD using chromatography and spectroscopy methods, and elucidate the mechanism of inhibition of typical active compounds from TAD on TLR4 pathway in MH7A cells by Western-Blot, immunoprecipitation and luciferase reporter assays. This study will prove that some aromatic derivatives in SI are selective TLR4 inhibitors, and contribute a lot to the therapeutic activity of SI on RA. Also, this study will provide us some useful clues to a better understanding of the common property of antipyretic and antidote medicines.

类风湿性关节炎（RA）在中医属于“痹症”范畴。蝉翼藤是“热痹” 治疗的代表性民族药物。其富含的占吨酮（XAN），能通过调节NF-κB和MAPKs通路，抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）的异常功能。基于现有研究和线索，推测蝉翼藤中以XAN为代表的特定芳香族衍生物作为迈克尔受体可结合于FLS上的TLR4/MD-2，阻断下游通路兴奋，产生RA治疗作用。本研究拟基于“成分敲入敲出”策略结合CIA动物模型，评估蝉翼藤中总芳香族衍生物（TAD）潜在的RA治疗活性；基于“细胞膜色谱”技术，遴选TLR4高亲和力活性成分；采用色谱和波谱法分离鉴定TAD中的活性单体；并以TLR4高表达MH7A细胞为研究模型，探讨活性单体对TLR4介导通路的调控机制，证明特定结构芳香族衍生物是TLR4的选择性抑制剂，是蝉翼藤RA治疗作用的重要物质基础，并借以探讨此类物质作为共性成分对于诠释清热解毒药药性内涵的科学意义。

民族药蝉翼藤中XAN（xanthone）成分具有良好的抗风湿活性，且对TLR4（Toll Like Receptor 4）下游NF-κB等通路存在有效的调控活性，本研究旨在探索该药中XAN为代表的多酚是否可以作为抑制剂选择性作用于TLR4，系统性改善类风湿性关节炎（RA）的炎症表现。本研究根据多酚分布差异制备两个待研组分，利用急性炎症模型初步进行活性比较，并采用胶原诱导关节炎（CIA）模型评价两者潜在抗风湿活性。而后通过分析不同条件下RAW264.7细胞的物质吸附性能差异遴选TLR4亲和性单体，进一步利用药理与分子生物学方法论证其本身及类似衍生物对TLR4通路及有关RA病理过程的影响。基于大孔树脂吸附联合酸碱处理方法，我们制备了多酚富集和剔除组分（PRF和PDF），福林酚等检测提示两者存在10倍的含量差异。相对于PDF，PRF在急性肺损伤模型实验中表现出更为突出的抗炎活性。与此相似，后者对CIA大鼠的关节的保护作用也更为明显。代谢组学、血清学及病理学证据均表明，这一现象与脂质代谢的差异化调控有关。相对于对照组，采集自LPS预刺激RAW264.7细胞的培养基中1,7-dihydroxy-3,4-dimethoxyxanthone（XAN-1）浓度大幅减少，提示该物质与高表达的TLR4存在较强亲和力。与此相符，XAN-1显著提高了TLR4热稳定性，有效抑制TLR4二聚化及NF-κB通路激活，表现出对该受体的选择性抑制活性。相应地，XAN-1对滑膜成纤维细胞中的NF-κB通路也存在下调作用，表现为选择性抑制TLR4主导的IKKβ磷酸化，并经由GADD45α诱发p38激动，阻断该细胞异常增殖。α-倒捻子素（MAN）作为XAN的衍生物，具有相似的体内外活性。其通过下调TLR4/NF-κB可有效缓解实验性关节大鼠的炎症症状，并改善免疫环境及关节损伤。与PRF相似，MAN也对NAMPT主导的能量代谢具有显著下调作用，除通过能量-炎症反馈直接缓解炎症反应以外，这一变化有利于改善氧化应激，从而实现TLR4/NF-κB通路持续性下调。本研究表明，XAN类物质作为蝉翼藤乃至多种天然药物中主要活性成分，可选择性抑制TLR4，阻断NF-κB等炎症通路激活，同时可下调NAMPT信号，进而经由能量-炎症反馈机制，放大其对于TLR4/NF-κB通路的影响，实现RA炎症表现的持续性改善。