脐橙果皮光泽型突变体蜡质合成和运输关键基因的筛选、分离及鉴定

申请者发现脐橙果皮光泽型蜡质突变体。本研究拟在本实验室已经完成的突变体与母树的果皮结构扫描电镜和它们的蜡质组分关键差异成分气质联用（GC/MS）研究基础上，构建纽荷尔脐橙母树与蜡质突变体的正反向抑制性差减杂交（SSH）文库，通过cDNA芯片杂交筛选出SSH文库中的阳性克隆，利用生物信息学分析和本实验室已经获得的母树和突变体果皮蜡质组成成分差异的相关信息，分离出关键的蜡质候选基因。利用电子克隆技术获得关键候选基因的全长cDNA，再通过转基因技术鉴定关键候选基因的功能，最终确定出控制果皮光泽度的蜡质突变体形成关键基因。初步揭示控制果皮光泽度的蜡质突变体形成机理。这将不仅为我国的柑橘外观品质育种提供具有自主知识产权的基因，而且为加快果皮光泽型这一特异种质资源中有利基因的发掘、克隆及利用提供技术平台。为今后通过基因工程改良柑橘果实外观品质打下坚实的理论基础。

脐橙果实表面含有大量的蜡质，这些蜡质具有防止气孔失水、抵御生物和非生物胁迫、调节果皮气体交换等功能。虽然有关脐橙果皮蜡质结构和成分的研究较多，但由于缺乏蜡质突变体，脐橙果皮蜡质合成和运输的分子机理目前尚不清楚。2006年，我们发现了一株纽荷尔脐橙天然芽变，该芽变的特点是果皮异常光亮。最近，该芽变被培育成果皮光泽型的新品种“赣脐3号”。在本项目中，我们比较了纽荷尔脐橙和“赣脐3号”在果实发育过程中，果皮蜡质结构和内外表皮蜡质成分的动态变化情况。结果表明：脐橙表皮蜡质晶体由大量的脂肪族蜡质成分和微量的萜类物质组成，而环状蜡质成分主要存在于脐橙内表皮蜡质中；从花后120天开始，“赣脐3号”外表皮蜡质含量和蜡质晶体数目均显著低于纽荷尔脐橙。为了解释导致蜡质结构和成分差异的分子机制，我们使用转录组测序技术（RNA-Seq）和荧光实时定量技术对纽荷尔脐橙和“赣脐3号”果皮基因表达差异情况进行了分析。我们一共筛选获得了63个脐橙蜡质相关差异表达基因，其中48个基因与蜡质合成相关，15个与蜡质运输相关。大部分的蜡质基因（52个）在“赣脐3号”果皮中下调表达。另外，我们克隆了CsCUT1/CsKCS6/CsCER6、CsFATB、CsCER1-LIKE12 、CsCER3、CsKCS10、CsSHINE1、CsSHINE2、CsSHINE3等蜡质基因的全长cDNA序列，并对其中的CsCUT1、CsFATB、CsSHINE1、CsSHINE2 和 CsSHINE3做了转基因功能验证。结果表明：超量表达各个蜡质基因的转基因植株表皮甲苯胺蓝（TB）染色程度和渗透率下降，蜡质晶体结构也发生了显著变化，证明它们参与了脐橙蜡质合成。综上所述，本项目的研究结果表明，大量蜡质合成和运输基因的下调表达导致了“赣脐3号”果皮外表皮蜡质成分含量下降，从而造成其果皮蜡质晶体数目减少，最终导致“赣脐3号”果皮光亮的表型。另外，本研究对理解脐橙果皮蜡质合成和运输的分子机制提供了新的线索，并为进一步鉴定脐橙蜡质基因功能提供了新的基因资源。