端粒酶逆转录酶对放射性直肠纤维化的影响与机制的研究

Telomerase activity and telomerase reverse transcriptase (TERT) expression have been found well in cancer, regeneration and wound healing. However, the relation between the TERT or telomerase and radiation-induced rectal fibrosis is still unclear. Our previous studies have demonstrated radiation-induce hypoxia contributed the development of rectal fibrosis, and telomerase activity increased in murine rectum after radiation. These results suggested telomerase and hypoxia maybe play a role in radiation-induced fibrosis. In this study, we will study the role of telomerase in induction of fibrosis, and the relation of hypoxia signal and telomerase in vitro and in vivo by hypoxia culture, TERT transfection, ELISA, mice model of radiation-induced rectal fibrosis and so on. Our study may be good to know the radiation-induced rectal fibrosis well and to improve the quality of life of patients who received pelvic radiotherapy.

端粒酶逆转录酶(TERT)及端粒酶除在肿瘤中高表达外，还在生理性再生能力强的正常组织及组织修复中高表达。迄今对TERT及端粒酶和放射性直肠纤维化的关系还不明确。我们前期研究证实放射导致的组织乏氧促进直肠纤维化发展，另外预实验提示端粒酶活性在放射导致的直肠晚期损伤中表达增加，但端粒酶在乏氧的条件下影响放射纤维化的机制还有待了解。为此我们提出假设，端粒酶和放射性直肠纤维化密切相关，且很可能受乏氧相关的传导通路的调节。为了验证这一假设，我们将通过成纤维细胞，血管内皮细胞，放射直肠纤维化小鼠模型，采用质粒转染，乏氧培养，ELISA等手段，从分子，细胞，组织及动物等多方面探讨TERT及端粒酶对放射性直肠纤维化的影响，明确端粒酶和乏氧微环境的相互关系。本研究将从端粒酶和乏氧微环境这个新视点为揭示放射性直肠纤维化的发生机制奠定基础，进而为放射直肠炎的防治提供新思路。

前期研究证实照射后的组织乏氧是促进组织损伤的重要因素之一。端粒酶逆转录酶(TERT)在组织修复中高表达,且可以促进组织损伤修复,但其对照射后组织乏氧加重的放射损伤的影响机制尚不明确。本研究主要探讨乏氧条件下TERT影响细胞以及组织损伤的机制。对C57BL/6N小鼠直肠部位进行单剂量25Gy照射，分别于照射后不同时间段取直肠组织，通过免疫染色检测组织损伤及纤维化程度，通过免疫组化检测乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）及端粒酶逆转录酶蛋白表达。构建TERT基因高表达成纤维细胞株细胞株，检测乏氧状态下，TERT基因过表达细胞与TERT基因干扰细胞的凋亡、细胞内ROS及细胞自噬水平的差异。进一步检测乏氧条件下，TERT干扰前后核转录因子-κB（NF-κB）激活状态及抑制NF-κB后细胞自噬以及细胞内ROS水平的改变。此外对常氧与乏氧状态下，TERT过表达和干扰细胞株谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）及细胞内线粒体膜电位水平的变化进行了分析。结果显示直肠组织随照射后时间的延长损伤逐渐加重，照射后12w直肠纤维化程度明显。组织损伤区HIF-1α与TERT表达明显增多，TERT多表达于细胞质。乏氧促进细胞凋亡的发生，同时促进细胞内ROS产生及细胞自噬水平，且具有时间依赖性。TERT基因过表达细胞相对TERT基因干扰的细胞具有较高的细胞自噬水平，较低的细胞凋亡率及ROS产生水平。自噬抑制剂促进ROS的水平提高及细胞凋亡，ROS清除剂则缓解了细胞凋亡。乏氧条件下，TERT基因干扰细胞相比TERT基因过表达细胞磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）表达水平降低，且变化主要表现在细胞核中；p-NF-κB 激活抑制剂可降低细胞自噬蛋白的表达水平。常氧和乏氧条件下，TERT基因过表达细胞相比TERT基因干扰细胞都具有较高的GSH/GSSG值，同时TERT基因干扰降低了细胞内线粒体膜电位水平。照射后的组织乏氧是加重组织损伤的因素之一。在组织修复过程中，TERT呈现高表达，TERT通过激活p-NF-κB，提高细胞自噬水平，进而清除乏氧导致的ROS，另外TERT可改变细胞的氧化还原状态，提高细胞抗氧化功能及线粒体膜电位水平，进而降低照射后乏氧对细胞的进一步损伤。综合以上提示TERT/NF-κB/自噬通路对放射导致的直肠损伤具有潜在的保护价值，其机制有必要进一步深入研究。