控制脐橙贮藏性能的关键果皮蜡质基因的分离和功能验证

The fruit peel wax layer acts as a outmost obstacle to protect navel orange against biotic and abiotic stresses. Moreover, its thickness, morphology, and composition is closely related to the storage capability of navel orange. In this project, the gene expression and proteomic profile differences will be compared between 'Newhall'navel orange (control) and its particular'glossy Newhall'mutant fruit peels by RNA-seq（quantification）and iTRAQ after 4℃ storge. At the same time, the transcriptomic and proteomic profiling will be related to screen out the key wax biosynthesis and export candidate genes controlling the storage capability of navel orange. Afterwards, combined with metabolite data of different wax morphology and composition changes between control and mutant fruit during 4℃ storge which have been obtained and the RT-qPCR and transgenic technology, the key wax genes controlling the storage capability of navel orange will be finally identified.This project will illuminate the molecular mechanism of the navel orange fruit peel wax changes during cold storge controlling its storage capability and provide a solid theoretic base for improving the citrus cold storage capability.

脐橙果皮蜡质是覆盖在果实最外面的保护层，其果皮蜡质的厚度、形态结构、化学成分等都直接影响果实的贮藏性能。该项目选用本课题组独有的脐橙果皮光泽型蜡质突变体为材料，采用RNA-seq（定量）与蛋白质组同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术，在温度4℃不同时间冷藏条件下，比较纽荷尔脐橙（母本-对照）和光泽型突变体低温贮藏后基因表达的差异、蛋白质组差异，并对转录组和蛋白组数据进行关联分析，进一步筛选出脐橙耐低温贮藏的关键蜡质候选基因。结合本课题组已获得的该研究材料在贮藏期间蜡质形态结构变化特征、蜡质组成成分变化的代谢组数据, 及通过实时定量（RT-qPCR）和转基因技术鉴定关键蜡质候选基因的功能，从而最终鉴别出脐橙耐低温贮藏的关键蜡质基因。达到初步阐明脐橙采后果皮蜡质成分变化会影响脐橙果实低温贮藏性能的分子机制，为今后通过基因工程改良柑橘低温贮藏性能打下坚实的理论基础。

前期研究表明，低温贮藏过程中，“纽荷尔脐橙”及其果皮光泽型新品种“赣脐3号”的果皮蜡质结构、蜡质含量和蜡质成分发生了不同的变化，从而导致两个品种贮藏性能差异。本项目进一步研究了脐橙果皮蜡质影响其低温贮藏性能的分子机制，并筛选出了控制脐橙低温贮藏性能的关键蜡质基因。首先，我们通过基因数字表达谱（DGE）和同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术，比较了低温贮藏前和低温贮藏过程中，“纽荷尔脐橙”和“赣脐3号”的基因和蛋白差异表达情况，筛选出了控制脐橙低温贮藏性能的蜡质候选基因和候选蛋白。同时对数字表达谱和蛋白组结果进行了实时定量PCR验证。然后，通过数字表达谱和蛋白组联合分析，找出了在mRNA和蛋白水平均差异表达的蜡质基因。再结合前期获得的低温贮藏过程中两种材料蜡质变化结果，进一步筛选出了CsFAR、CsKAR、CsCER10、CsABCG2-1、CsHHT1、CsCER1、CsLACS、CsTPS1等控制脐橙低温贮藏性能的蜡质候选基因。为了验证这些蜡质候选基因的功能，我们首先从脐橙中克隆出了CsABCG2-1、CsCER10、CsKAR等蜡质候选基因，并进行了详细的生物信息学分析。同时，实时定量PCR试验表明，在大部分低温贮藏时期，这些蜡质基因在“赣脐3号”果皮中的表达量均显著低于“纽荷尔脐橙”。然后，我们构建了CsABCG2-1、CsCER10、CsKAR和CsCER1基因的超量表达载体，并通过根癌农杆菌转化了番茄。转基因试验表明，超量表达CsABCG2-1的转基因番茄的侧支数目、开花数目和结果数目均显著低于野生型番茄，果实成熟期也早于野生型番茄。低温贮藏过程中，超量表达CsABCG2-1的转基因番茄果皮蜡质总量和各蜡质组分含量均显著高于野生型番茄，这可能是导致低温贮藏过程中转基因番茄失重率低于野生型番茄的主要原因。这些研究结果说明，CsABCG2-1具有调控果实蜡质含量从而影响果实贮藏性能的功能。