建立定量分析方法研究卵母细胞染色质构型协同表观遗传修饰调控基因转录和卵质量的模式

Chromatin configuration is a indicator of aggregation and distribution of chromatin, it is height correlation to the genetic transcription and quality of oocyte. But we still don't know the mechanism. Different configuration was classified in different animals. But the same configuration in different animals stand for different quality of oocytes. This remind us that the methods used now is not fit for further research. New methods will be build in this project with the use of 3D confocle scanning and quantitative fluorescence analysis. Expression the fluorescence intensity and space distribution with numerical value. Improve the subjective morphology to quantitative analysis. Then study the chromatin configuration with this new method. Study the DNA methylation, histone acetylation and histone methylation with indirect staining. Study the transcription of Oct4 and GDF9 with realtime PCR. Study the quality of oocyte with IVM, and distinguish the difference with IVF and SCNT. Finally build the modle of chromatin configuration together with epigenetic modification regulate and control the genetic transcription and quality of oocyte.

染色质构型是描述染色质凝集程度和空间分布的指标，它与基因转录和卵质量高度相关，但其调控卵质量的机理尚不清楚。不同动物根据形态描述对其卵母细胞染色质构型进行了划分，但相同形态描述的构型在不同动物中却代表不同的卵质量。这提示我们，现行的染色质构型划分方法已经不适当。本项目将改进卵母细胞染色质构型的研究方法，利用3D激光共聚焦扫描和图像荧光定量分析技术，把细胞核内染色质的荧光强度和空间分布定量地用数值表现出来，把形态学描述改进为荧光定量分析。然后利用此方法研究卵母细胞染色质构型；利用免疫荧光染色的方法分别研究对应卵母细胞的DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化；利用定量PCR检测对应卵中Oct4、GDF9等基因的转录水平；利用体外成熟研究对应卵母细胞的质量，并通过体外受精和细胞核移植确定这种质量差别存在于细胞核还是细胞质中。最终将构建染色质构型协同表观遗传修饰调控基因转录和卵质量的模型。

染色质构型是反应未成熟卵母细胞质量的指标之一。但在不同物种中，相同染色质构型代表的卵母细胞转录水平、发育潜能却不同。这些矛盾表明，现有的染色质构型形态学划分方法已经不适当。本项目改进了卵母细胞染色质构型的研究方法，把细胞核内染色质的荧光强度和空间分布定量地用数值表现出来，提出凝集程度（Aggregation Degree，AD）和空间分布（Spatial Distribution，SD）两个指标，其中AD=荧光强度/荧光面积，SD=荧光面积/生发泡面积。这两个指标构成染色质构型定量分析指标体系，形成了客观的染色质构型荧光定量分析方法。本项目首先利用该方法研究了猪、羊及小鼠未成熟卵母细胞的染色质构型，然后利用免疫荧光染色的方法分别研究对应卵母细胞的DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化等表观遗传模式，再利用定量PCR 检测对应卵中DNMT1、EZH2、Oct4、GDF9 等基因的转录水平，利用体外成熟、孤雌激活、体外受精等技术研究对应卵母细胞的质量，结果发现：1）减数分裂和发育潜能较差的未成熟卵母细胞，AD值较小，SD值较大；当SD>0.4时，卵母细胞转录活跃，当SD<0.3时，卵母细胞转录停止。2）AD值较大，SD值较小时，未成熟卵母细胞中全基因组DNA甲基化水平较高，且与AD值较小，SD值较大组卵母细胞差异显著。3）AD值较大时，未成熟卵母细胞中H3K27乙酰化水平较高，且与AD值较小组卵母细胞差异显著。但SD值对H3K27乙酰化水平影响不大。4）AD值较大时，未成熟卵母细胞中H3K4三甲基化水平较高，且与AD值较小组卵母细胞差异显著。但SD值对H3K4三甲基化水平影响不大。5）SD值较低时，未成熟卵母细胞中H3K27三甲基化水平较低，且与SD值较大组卵母细胞差异显著。但AD值对H3K27三甲基化水平影响不大。6）SD值较大的小鼠NSN染色质构型卵母细胞中，表观遗传相关酶基因DNMT1、EZH2，表观遗传相关基因Trim-28的表达水平，都显著高于SD值较小的小鼠SN染色质构型卵母细胞，但发育相关基因GDF9的表达情况却完全相反。综上，本项目最终构建了染色质构型协同表观遗传修饰调控基因转录和卵质量的模型。