扇贝应对海洋镉污染生理适应的分子机制研究

Heavy metal pollution in food is one of the major problems affecting food safety. Cadmium is a kind of heavy metal which is non-essential, highly toxic and easily accumulated. It enters the food chain poisoning animals and humans. Shellfish accumulated heavy metals easily because of their low metabolic rate. Scallops were able to accumulate high amounts of cadmium specially compared to other shellfish, and the content of cadmium in edible part was several times higher than that ruled in national standard, which has become the focus of attention. Long-term survival in the ecological environment of heavy metal contamination can lead to species adaptability. Species select some effective adaptation strategies when the environment they lived is contaminated by cadmium. In mollusk, the presence of cadmium-binding protein is a protective mechanism to deal with cadmium toxicity. Currently the researches on molecular mechanisms of high tolerance to cadmium in scallop are deficient and limited. The present study was designed to obtain transcript sequence data and examine gene expression in tisues of scallops Chlamys farreri exposed to cadmium based on RNA-Seq and LC-MS/MS technology. The key genes and cadmium-binding protein were screened and verificated by RACE technology, RT-PCR, and recombinant protein technology. The aim of this study is to better explain the molecular mechanisms of high accumulation of cadmium and physiological adaptive mechanisms to deal with cadmium contamination in scallops, and provides a theoretical basis for early warning of cadmium pollution, quality and safety control of seafood, gene regulation and breeding research.

镉作为生物非必需、毒性极强的蓄积性重金属，易通过食物链进入人体，严重威胁人类健康。扇贝相对于其他贝类能够特异性蓄积镉，可食部分镉含量高出国家标准几十倍，成为水产品安全领域关注的焦点。长期生存在重金属污染的生态环境例如高镉环境中的物种，会选择有效的适应策略，可引发物种的适应性。软体动物中镉结合蛋白的存在是一种有效的应对镉毒性的保护机制。目前围绕扇贝对镉高耐受性的分子机制的研究尚存许多空白和不足。本项目拟以镉胁迫下的栉孔扇贝组织为研究对象，在微观层面开展研究。运用差异基因筛选技术，构建栉孔扇贝转录组文库并筛选差异基因；通过离子交换色谱技术和质谱鉴定筛选关键蛋白，发掘扇贝体内的镉结合蛋白；通过酵母功能互补验证实验验证关键基因和蛋白的功能。为深入阐释扇贝高蓄积镉的分子机制及扇贝应对镉污染的生理适应机制构建平台，并为镉污染早期预警、水产品质量安全控制、基因调控及育种研究提供理论依据。

本研究测定了镉在栉孔扇贝体内主要的蓄积部位为消化腺组织，且在鳃和消化腺组织的累积量与胁迫浓度大小呈正相关性，随胁迫时间延长，累积量表现出曲线变化规律。另外，本研究采用新一代测序技术对栉孔扇贝鳃和消化腺组织分别进行高通量转录组测序。在鳃中获得174,286转录本，组装得到82,800个unigenes，平均长度833bp，N50长度为1521bp。基因注释发现了大量参与免疫通路和Cd刺激反应的基因。比较转录组发掘了差异表达基因128个，其中68个上调基因，60个下调基因，主要富集于有机酸代谢过程，羧酸代谢过程，细胞代谢过程和化学物刺激的响应等生物学过程，筛选镉蓄积相关基因包括双氧化酶（DUOX），髓样分化因子88（MyD88），肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRS），金属硫蛋白（MT），黄蛋白基因（Y-xlc），谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），谷胱甘肽S-转移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）等。. 在消化腺中获得227,673条转录本，拼接得到105,071条unigene，平均长度829bp，N50长度为1573bp。比较转录组筛选出3800个差异表达序列，大部分差异基因参与的生物学过程包含ATP结合转运子（ABC蛋白），氧化磷酸化，真核细胞的核糖体生物合成，MAPK信号通路，谷胱甘肽代谢，丝氨酸和苏氨酸代谢，甾体激素生物合成等生物学过程。筛选到镉蓄积相关基因包括ABC转运蛋白家族，HSP家族和CYP家族，金属硫蛋白（MT），金属耐受性蛋白（MTP），二价离子转运子（DMT1）等。. 利用iTRAQ技术共鉴定到差异蛋白48个，其中上调蛋白18个，下调蛋白30个。鉴定得到的与镉蓄积相关的蛋白主要是热休克蛋白、过氧化氢酶、V型ATP酶、细胞骨架相关蛋白、NADH脱氢酶、锌指蛋白、ABC转运子等蛋白家族。对转录组和蛋白组数据进行联合分析显示，共得到16个unigene与镉胁迫密切相关。其中上调表达基因unigene0002618和下调表达基因0000904是栉孔扇贝应对镉胁迫的关键基因。PPI网络分析显示unigene0009750是程度最高的重要结点。. 本研究利用镉胁迫后栉孔扇贝鳃和消化腺组织为材料，采用分子生物学方法，发掘栉孔扇贝镉蓄积相关基因及蛋白。研究结果有助于全面阐释栉孔扇贝蓄积镉的分子机理。