玄参科植物柳穿鱼自交不亲和系统S基因的克隆、鉴定和功能进化研究

核酸酶类自交不亲和(SI)是茄科、蔷薇科和玄参科等植物广泛采用的一种生殖策略。本项目研究模式植物金鱼草的近缘物种柳穿鱼的SI性状，以河北和北京等地的3个野生群体为研究对象，同源克隆获得30对以上S位点基因- - 包含花柱因子LvSRNase和花粉因子LvSLF及Paralogy的序列信息，结合人工杂交鉴定基因型及单倍型组成，生化方法验证LvS-RNase与SCF复合体之间的相互作用，转基因验证LvSLF的特异性识别功能等。在群体水平分析S位点的等位基因多态性与遗传结构、等位基因系谱与正向选择位点、重组与连锁不平衡等，揭示玄参科S基因在负依频选择作用下的群体遗传学特征。本项目将探索在核酸酶类SI系统中以群体数据研究成对的花柱S基因和花粉S基因的进化特征，以期验证单倍体选择和致同进化等可能是造成花粉S基因SLF低多态性的原因，进而为核酸酶类SI系统的单系起源及野生金鱼草的驯化提供证据。

S-核酸酶类自交不亲和是真双子叶植物广泛采用的一种防止自交促进异交的生殖策略，最新研究表明S-位点上多个SLF重复基因都是参与自交识别过程的功能性花粉因子，柳穿鱼近缘种金鱼草中含有40多个SLF基因。原先关于研究柳穿鱼群体中1个S-RNase和1个SLF共进化的思路已然失去科学基础，故调整为解析柳穿鱼模式材料中S-RNse和SLF亚家族的基因构成，并研究群体的遗传多样性水平，为下一步对自然群体中花粉S基因和花柱S基因的进化研究打下基础。本项目首次尝试利用RNAseq等“组学”技术进行大规模基因克隆，在柳穿鱼基因组中克隆到了25个SLF基因和3个S-RNase/SRNL基因亚家族的相关成员，表达谱分析显示二者分别为花粉和花柱特异性表达的基因，25个SLF基因全部为花粉S基因，3个S-RNase/SRNL中有1个花柱S基因。系统发育分析显示，车前科SLF基因亚家族具有快速生死进化和致同进化的特征，S-位点SLF基因之间的基因转变等同质化因素是等位基因序列之间存在较少差异的原因，而S-RNase/SRNL基因亚家族在生死进化的基础上有明显的谱系分选特征。本研究的人工杂交实验显示柳穿鱼4个自然群体都是自交不亲和群体；RAPD数据发现柳穿鱼的基因分化系数Gst为0.138，柳穿鱼的遗传变异主要存在于居群内，与人工杂交试验发现4个群体中大部分个体自交不结实的遗传学研究结果相一致；对柳穿鱼4个cpDNA非编码序列rpl32-trnL、trnQ-5’rps16、trnT-trnL、trnS-trnG进行序列分析和筛选，在rpl32-trnL中蕴含24个潜在的简约性信息位点，可以用做研究柳穿鱼遗传多样性和遗传分化的理想分子标记；进而对68个柳穿鱼个体连同外类群金鱼草属中的3个个体共计71个材料的cpDNA序列进行测定比对分析，发现种间分化明显，而L. vulgaris群体间的分化程度则存在较大差异，但不同居群之间的基因交流也是频繁发生。本研究首次解析了柳穿鱼模式材料中S-RNase和SLF基因亚家族的构成和进化特征，并研究了自交不亲和性状对柳穿鱼自然群体遗传多样性水平的影响，为下一步深入研究自然群体中花粉S基因和花柱S基因的进化特征打下基础。