酵母糖基化修饰可控系统的建立及其表达的流感血凝素抗原性研究

N-glycosylation is crucial for antigen's properties. It is proved that influenza viruses evade immune pressures might be one of the causes for their Oligosaccharides changed. However, N-glycosylation modifications on glycoproteins are uncontrolled to date. The glycan profiles of recombinant proteins produced in mammalian cells and yeast are predominantly heterogeneous. Therefore, the relationships between certain glycans and protein functions cannot be clarified by means of current expression systems. The use of methylotrophic yeast system for foreign protein expression is increasing dramatically, since the advent of the first world licensed genetically engineered vaccine antigen for hepatitis. Yeasts are capable of performing many human posttranslational modification reactions, including N-linked glycosylation. However, glycoproteins produced in wild-type yeast contain potentially immunogenic high-mannose type N-glycans, limiting the use of yeast expression systems for vaccinal protein. This study will be preformed to (i) elimination of some endogenous glycosylation reactions and (ii) the recreation of the sequential nature of mammalian cell glycosylation in the ER and Golgi. The hemagglutinin (HA) based subunit vaccine for H1N1 was used as an example to study glycoprotein production in glycoengineered Pichia pastoris. In this study, we will measure the levels of recombinant yeast derived HA protein elicting neutralizing antibody in mice and detect the sera from immunized animals exhibiting Hemagglutination inhibition (HI) activity. The combination of glycoengineered Pichia pastoris expression system with established quality control methods maybe provide a mechanism for rapid large scale production of influenza vaccines in the face of influenza pandemic threat.

蛋白的糖基化修饰对疫苗蛋白的抗原性具有重要影响，如流感病毒糖基化修饰的变化已成为其免疫逃逸的机制之一,但现有各种糖蛋白表达系统对糖基的修饰过程都是不可控的，因此一般只能通过糖基化位点的突变来研究糖基化"有无"对糖蛋白的影响，而不能详细研究特定结构糖基对糖蛋白的影响。酵母与哺乳动物细胞在内质网的糖基化修饰过程相同，但进入高尔基体后的糖基修饰却明显区别，这是酵母不能用于大部分糖蛋白疫苗生产的重要原因。本研究将通过酵母自身关键酶基因的敲除，阻断其原有的过度糖基化修饰，然后利用不同糖基转移酶的组合，构建一系列具有各种N-糖基结构合成能力的新型酵母表达系统，并以流感病毒血凝素抗原为模型，分析具有不同N-糖基修饰的血凝素抗原体外体内的活性，特别是免疫血清抗体的中和活性，探讨不同N-糖基结构对糖蛋白抗原活性的影响，揭示糖基化修饰与抗原活性之间的关系，为新型糖蛋白疫苗表达系统的建立提供技术基础。

蛋白的糖基化修饰对疫苗蛋白的抗原性具有重要影响，酵母与哺乳动物细胞的糖基化修饰过程存在明显区别，已经成功地应用于乙肝抗原的制备甲醇酵母受到了广泛地应用。酵母作为真核生物，具有翻译后修饰功能，包括N-糖基化修饰。然而，野生型酵母表达的糖蛋白因发生过度甘露糖基化修饰而存在潜在的免疫原性，这是酵母不能用于大部分糖蛋白疫苗生产的重要原因。流感血凝素和唾液酸酶是流感病毒表面的主要蛋白，是流感疫苗的主要成分。本研究将通过酵母自身关键酶基因的敲除，阻断其原有的过度糖基化修饰，然后利用不同糖基转移酶的组合，构建一系列具有各种N-糖基结构合成能力的新型糖基工程酵母表达系统。本研究通过基因工程技术，以H7N9流感病毒为模型，建立了基因工程酵母制备H7N9流感病毒血凝素亚单位颗粒疫苗的技术。通过克隆H7N9流感病毒血凝素HA基因，构建酵母高效表达菌株，并建立发酵、纯化工艺，制备获得了血凝素糖蛋白亚单位纳米颗粒候选疫苗，在电镜下呈30nm左右的星状颗粒结构；还原型SDS-PAGE分子量表现为66KD，经胰酶酶切后，可得到HA1和HA2，而在变性状态下，HA0被完全切碎，说明获得的重组HA0具有天然的HA结构。在TSKG4000的凝胶色谱中，为分子量大于670KD的均一峰，纯度大于90%，且具有类似流感病毒的血凝活性，在小鼠体内诱导的抗体，对H7N9病毒的血凝活性具有中和作用。在针对H7N9流感病毒的小鼠保护性实验中，该疫苗免疫的小鼠100%存活，而对照组全部死亡，证明该颗粒型流感疫苗对小鼠具有良好的保护性。本研究为基于新型糖蛋白疫苗表达系统的快速疫苗生产提供技术基础。