N-糖基化修饰位点优化促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中表达的研究

The Pseudomonas aeruginosa elastase is a promising biocatalyst for bipeptide synthesis in organic solvents, and improving the expression of the protein is a top priority for its industrial application. Our previous study revealed that the addition or deletion of N-glycosylation sequon （N-X-S/T）could depress or stimulate it expression in Pichia pastoris. Accordingly, the expression levels of the recombinant elastase will be further enhanced by optimizing its N-glycosylation sites in this project. In addition, the relationship between the expression level of the glycoproteins with varied N-glycosylation sites and the ER stress、UPR and ERAD levels of their hosts will be investigated, aiming at revealing the biological mechanism behind the influence of N-glycosylation of the recombinant elastase on their expressions.

弹性蛋白酶在催化有机溶剂系统中合成二肽方面有着良好的应用前景，提高弹性蛋白酶在宿主中分泌表达水平是其工业化应用的关键问题之一。申请人的研究工作基础表明，在弹性蛋白酶的一级结构中引入或删除N-糖基化修饰序列（N-X-S/T）可以显著地促进或抑制弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达。在原有工作基础上，本项目进一步寻找能促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中表达的N-糖基化修饰位点，并研究N-糖基化修饰位点优化促进弹性蛋白酶表达与宿主内质网压力、UPR和ERAD水平变化关系，进而揭示N-糖基化修饰促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中表达的机制。

本项目通过共表达Hac1p转录因子激发宿主非折叠蛋白应答（UPR），研究N-糖基化修饰与UPR通路对蛋白在毕赤酵母中的表达作用；考察了表达Hac1p转录因子对胞内Kar2p水平的影响，进而研究UPR通路激发的情况。研究发现，PAOX1和PGAP这两种启动子表达Hac1p都可有效地对激发UPR，两者之间没有明显差异；毕赤酵母的Mut+和MutS表型对激发UPR水平没有影响，对壳聚糖酶的表达也没有影响；表达Hac1p激发UPR影响了宿主在BMMY培养基中生长速度；提高了其表达壳聚糖酶的最佳诱导温度；研究发现弹性蛋白酶在N43、N212和N280三个位点的N-糖基化修饰在UPR激发背景下都能促进弹性蛋白酶的表达：N43Q、N212Q、N280Q、N43Q/212Q、N43Q/N280Q、N12q/N280Q、N43Q/N21q/N280Q和野生型弹性蛋白酶的表达水平分别增加了2.2-、1.9-、2.6-、3.2-、3.5-、3.8-、3.9-，和1.8倍，由于缺乏必要的N-糖基化修饰，N43Q/N212Q/N280Q、N212Q/N280Q、N43Q/N212Q和N43Q/N280Q突变蛋白的表达水平显著降低，值得注意的是，激发宿主UPR通路更显著地提高此类蛋白的表达水平。PAOX1和PGAP共表达Hac1p都能促进弹性蛋白酶和壳聚糖酶的表达，另外，相比较启动子PAOX1，利用PGAP共表达Hac1p提高了壳聚糖酶表达水平的21％。本项目还比较了常见的Kar2p、PDI分子伴侣、以及Hac1p转录因子共表达对壳聚糖酶表达作用的差异，发现共表达Kar2p抑制了其表达水平的15％，PDI共表达对目标蛋白表达几乎没有影响；共表达Hac1p提高其表达水平的41％；N-糖基化修饰促进目标蛋白表达的机制与UPR通路的效应可能存在耦合作用。另外，本项目利用Cre/loxP系统，创新地采用两步法策略，成功地敲除了毕赤酵母KM71的CNX蛋白基因，为后续研究N-糖链进入CNX循环对糖蛋白折叠和表达作用机制奠定了基础，同时也提供了一种易操作的基因敲除技术。