基于FoxO1信号通路研究二仙汤增强成骨细胞骨形成功能防治骨质疏松的分子机制

It is a pivotal topic for prevention and cure of osteoporosis, which to discover the molecular mechanism for increase bone formation in Chinese Medicine Herbs. It is established that the Er-Xian Decoction,a famous applicable prescription for climacteric syndrome in clinic,play an important role in cell proliferation,bone formation, ROS clear, FoxO1 activity in our early study. The ROS is an important factors of the pathogenesis of osteoporosis. It was established that the FoxO1, a tumor suppressor gene, control its lifespan and function in the osteoblast. However,the Er-Xian Decoction is unclear how it decrease FoxO1 activity and the FoxO1 increase bone formation. In this study, the relationship between Er-Xian Decoction induced bone formation and ROS, FoxO1 signaling pathway, which the signaling pathway induced by ROS and changed by Er-Xian Decoction.The special inhibitor for signaling pathway and proteomics technique were used for exploring different protein profile. The relationship between different protein profile and ROS, FoxO1 signaling pathway were established after comparing with different protein profile when Er-Xian Decoction was administrated. And the Real-Time PCR, Western blot, Laser scanning confocal microscope and other techniques were used for verifing new signaling pathway. It will be an important base for discovering the molecular mechanism of enhance bone formation and the target for osteoporosis cured by Er-Xian Decoction.

研究中药促进骨形成的作用和机制是防治骨质疏松的重要课题。我们前期研究发现中药复方二仙汤能清除活性氧（ROS），降低FoxO1活性，增强成骨细胞的骨形成功能，防治骨质疏松。ROS是骨质疏松产生的主要因素。FoxO1属肿瘤抑制基因，能调节成骨细胞的功能和寿命，但二仙汤增强成骨细胞骨形成功能的分子机制并不清楚。本项目拟考察二仙汤增强成骨细胞骨形成功能与ROS、FoxO1信号通路的关系，选择PI3K/Akt特异性阻断剂，采用差异蛋白组学技术，分析比较二仙汤治疗前后骨组织或成骨细胞产生的差异表达蛋白，确定各差异表达蛋白与ROS、FoxO1间的关系，筛选出重点蛋白。通过对重点蛋白过表达、沉默等，以Real Time-PCR、Western blot等验证蛋白表达对成骨细胞骨形成功能的作用，分析信号通路和药物作用靶点。项目实施将阐明二仙汤促进骨形成的分子机制，为临床上应用二仙汤防治骨质疏松提供理论依据。

骨质疏松症是常见的衰老性疾病，临床上中药复方二仙汤常用于防治骨质疏松症，但其机制并不清楚。本项目通过复制去卵巢大鼠骨质疏松模型，研究二仙汤抗骨质疏松的作用。开展骨蛋白组学研究，分析差异蛋白。开展血清代谢物组学研究，分析标记代谢物。以过氧化氢刺激成骨细胞复制骨形成减少细胞模型，研究二仙汤含药血清对成骨细胞增殖、分化、骨形成的作用，及细胞蛋白组学分析。从动物和细胞模型层面分析二仙汤对PTEN、p-PTEN、Akt、p-Akt、Fox01、p-Fox01等信号分子表达的影响及与骨形成的关系，结合PI3K信号通路阻断剂LY294002，钙通道阻滞剂硝苯地平，研究成骨细胞骨形成和相关信号分子的作用。验证了蛋白组学分析筛选出的重点差异蛋白Marcks、Rbm10、Chad、Comp基因的表达。筛选出了41个与二仙汤防治骨质疏松相关的差异蛋白，碳酸酐酶2、整合素β1等相关差异蛋白质可能是作用靶点。二级质谱鉴定出柠康酸、2-氧代戊酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、嘌呤等5个生物标志物，涉及体内氨基酸代谢、脂代谢、嘌呤代谢等。以二仙汤主要单体成分芒果苷为基础，研究成骨细胞骨形成与细胞内ROS变化，与ERK1/2信号通路、FoxO1、PTEN、AKT等信号分子的关系。结果显示二仙汤能改善去卵巢大鼠骨质疏松，提高骨密度，促进骨形成相关蛋白OPG、BMP-2的表达，提高骨形成相关基因β-catenin、Runx2 mRNA的表达，与PTEN/AKT/FoxO1信号通路有关。阻断PI3K信号通路、ERK通路、钙离子通道、干扰FoxO1，均可影响成骨细胞骨形成，FoxO1是关键调节点。项目初步阐明了二仙汤防治骨质骨质疏松的分子机制，而PTEN/AKT/ERK/FoxO1信号通路与细胞增殖、凋亡有关，是衰老疾病的关键，对扩展二仙汤在临床的应用范围起积极作用。