全身麻醉药丙泊酚对丘脑外侧区-网状核神经通路的作用机制研究

Neural circuit from the lateral hypothalamus (LH) to thalamic reticular nucleus (TRN) exert a strong control over thalamocortical synchronization, and coordinate sleep-wake rhythms. General anesthetics suppress the neuronal activity of thalamocortical and arousal nuclei, which gave a strong hint that general anesthetics may induce unconscious by affecting the LH-TRN circuit. Our pre works have found that microinjection of agonist\antagonist of GABAA receptor in TRN altered the efficacy of propofol anesthesia; patch clamp experiment showed that propofol enhanced the inhibitory synaptic transmission in TRN, however, more mechanism still need to be elucidated. This project focus on the inhibitory synaptic transmission in the LH-TRN circuit, investigate the effects of propofol on the neural states of the LH and TRN and its role in the functional connectivity in the LH-TRN circuit using a combination of genetically encoded chemogenetic tools and in vitro and in vivo electrophysiological methods. In addition, at the synaptic and molecular level, we will utilize anterograde tracing and immunofluorescence methods to explore the specific action of propofol on the LH-TRN circuit. This project will support the mechanism exploration of anesthesia-induced unconscious at the hypothalamus and thalamus levels.

下丘脑外侧区（LH）至丘脑网状核（TRN）通路是协调丘脑-皮层同步活动的重要神经通路，具有调控睡眠-觉醒的作用。而抑制皮层同步活动和觉醒核团正是全身麻醉药的作用特点，推测全身麻醉药可能通过影响LH-TRN通路导致意识消失。项目前期工作发现TRN内微注射GABAA型受体激动剂或拮抗剂可影响大鼠对丙泊酚麻醉的敏感性，且膜片钳实验证明丙泊酚可增强TRN内抑制性突触传递，但机制尚待阐明。故本项目将LH与TRN间抑制性突触连接作为研究对象，通过行为学和脑区场电位记录实验观察丙泊酚对LH和TRN功能状态的作用，并分析药物遗传学技术特异调控LH-TRN通路活性对丙泊酚麻醉效应的影响，进而运用神经示踪和免疫荧光等技术在突触和分子层面阐明丙泊酚对LH-TRN通路的作用机制。上述研究将有助于在下丘脑-丘脑神经通路层面探索全身麻醉致意识消失的机制。

项目背景：.丘脑网状核(TRN）能够影响整个丘脑-皮层系统的兴奋性。下丘脑外侧区(LH）内的GABA能神经元投射至TRN并抑制 TRN神经元。故项目假设全身麻醉药物对 LH-TRN 通路的影响可能是全身麻醉药物导致意识消失的关键过程。.主要研究内容、结果和关键数据.1. 利用AVV-ChR2-mCherry光遗传技术，验证 LH内GABA能神经元在 TRN内投射分布情况，激活 LH-TRN GABA能通路对丙泊酚麻醉的影响，发现LH范围广，其内GABA能神经元零散分布，难以分析LH-TRN GABA能通路在丙泊酚麻醉中的作用；.2. 神经通路实验方面尝试在TRN内注射去甲肾上腺素（NE），发现明显延长丙泊酚麻醉时间，从422.4 6 48.19 s 延长至486.6 ± 57.32 s；.3. 利用化学遗传学技术，特异激活蓝斑—TRN的NE能神经通路，发现明显延长丙泊酚麻醉时间，从426.1 ± 38.75 s 延长至466.1 ± 44.57 s，并降低丙泊酚EC50，74.00±2.08mg/kg至 64.77±3.40mg/kg；.4. 利用脑片膜片钳技术，发现α1型受体介导NE对TRN神经元活动的调控；.5. 根据TRN神经元亚型新发现，利用免疫荧光双染技术观察TRN内小清蛋白阳性神经元（parvalbumin-expressing neurons，PV）和生长抑素阳性神经元（somatostatin-positive neurons，SOM）的比例和分布；.6. 利用 c-Fos 免疫荧光染色双标技术，对比丙泊酚麻醉过程中和苏醒过程中TRN内PV和SOM神经元的激活情况；.7. 利用基于Gcamp6钙指示蛋白的活体光纤钙信号记录技术，观察丙泊酚麻醉过程中和苏醒过程中TRN内PV和SOM神经元的活性变化；.8. 利用光遗传技术和Cre-on转基因小鼠，研究特异激活TRN内PV和SOM神经元对小鼠丙泊酚麻醉苏醒时间的影响，PV: 357.38±16.04s vs 269.50±13.24s; SOM: 378.25±8.70s vs 286.88±8.45s。.科学意义：证明了投射至TRN的外源性神经通路是全麻机制的靶点，TRN内不同亚型神经元在丙泊酚中发挥不同作用。