猪原始生殖细胞自我更新调控基因的挖掘与验证

Porcine are widely regarded to be ideal preclinical model systems for human disease, pharmaceutical research, and organ transplantation, due to their similarities to humans in anatomy and physiology. Establishing porcine embryonic stem cell (ESC) line is essential for genetic modification. Although several porcine ESC-like lines have been reported, these cells failed to maintain self-renewal capacity and pluripotency after certain passage, which limits its application. We are not familiar with the molecular mechanisms involved in self-renewal of porcine ESC is the reason why we can not get the de novo ESC lines. So, to identify modulators and elucidate their functions on self-renewal of ESC from porcine is very important. In our previous study, we compared the establishing efficiency of porcine primordial germ cells (PGC) derived from embryos of different gestational stages and optimized in vitro culture system of porcine PGC/EGC. Our current study is to establish a cDNA interference library by cloning of enzyme-digested cDNA of porcine EGC into BamHI site of convergent dual promoter RNAi vector. By transfecting the RNAi library into porcine EGC, we will find modulators involving in self-renewal of porcine EGC by loss-of-function screening. Then we will study the molecular modulating mechanism of these modulators by RNAi, overexpression and genome-wide RNA sequencing techniques. The study will provide broad insights into the determination of the balance between self-renewal and differentiation of porcine EGC and set theoretical basis for further establishment of porcine EGC.

猪作为潜在的人类器官移植供体和医疗模型已被广泛接受，猪胚胎干细胞系的建立能够为其遗传修饰提供更多便利。然而现已获得的猪胚胎干细胞普遍存在自我更新能力差、易分化等问题，这极大地制约了其应用。究其原因，是我们对调控其自我更新和分化的分子机制不甚明确，因此，寻找影响猪胚胎干细胞增殖、分化的关键基因并阐明其功能与作用机制是十分必要的。基于本课题组前期摸索的能够连续传代的猪EG细胞培养体系，现拟构建针对该类细胞的cDNA RNAi文库，应用该文库转染猪EG细胞以建立功能缺陷的细胞库，然后通过表型筛选、PCR扩增、测序、基因检索获知猪EG细胞自我更新的负调控基因，并在增殖、分化的EG细胞中检测其表达模式，最后结合RNAi、过表达后的细胞表型变化和转录组表达图谱探讨其功能和作用机制。相信该问题的阐述不仅能为猪胚胎干细胞的最终建系提供理论依据，也为挖掘未知基因及阐明已知基因新功能提供了新的切入点。

猪由于其生理、病理和免疫等过程与人体具有非常大的相似性，同时又拥有丰富的群体资源和实验便利性，一直以来被认为是开展人类医学临床前试验的最佳动物模型和人体异种器官移植的理想供体。因此，猪胚胎干细胞系的建立一直备受关注，然而目前获得的猪胚胎干细胞普遍存在自我更新能力差、易分化等问题，这极大地制约了其应用。究其原因，是我们对调控猪胚胎干细胞自我更新和分化的分子机制不甚明确，因此，寻找影响其增殖、分化的关键基因并阐明其作用机制是十分必要的。本项目正是以此为立足点，在无血清、无饲养层培养条件下，研究了多种细胞因子对猪原始生殖细胞重编程的作用，结果发现bFGF通过抑制blimp1核表达促进猪原始生殖细胞重编程为EG细胞；在此基础上，课题组构建了针对猪EG细胞的cDNA干扰文库，并应用该文库在诱导分化的条件下筛选得到猪EG细胞自我更新的负调控基因brg1；此后，课题组利用单基因功能研究方法验证了brg1对猪EG细胞自我更新能力的影响，并结合转录组测序和生物信息学分析探究了其可能的作用机制。该问题的阐述不仅能为猪胚胎干细胞系的最终建立提供理论依据，也为挖掘未知基因及已知基因新功能提供了新的切入点。经过3年的团结协作，课题组按计划完成了项目设定的研究内容并达到了预期目标，相关研究结果已发表SCI论文2篇，核心期刊论文2篇，申请国家发明专利3项，授权1项，另有2篇SCI文章待发表。项目实施期间，课题组成员中有1人入选国家“万人计划”科技创新领军人才，1人入选省级青年创新人才培养计划，1人博士后出站，3人研究生毕业。